Spannungsbildgebung enthüllt die dynamischen elektrischen Signaturen menschlicher Brustkrebszellen

May 16, 2023

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1178 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Krebszellen weisen ein im Vergleich zu normalen Zellen depolarisiertes Ruhemembranpotential (Vm) auf und weisen aktive Ionenleitfähigkeiten auf, die einen direkten Einfluss auf ihr pathophysiologisches Verhalten haben. Trotz Ähnlichkeiten zu „erregbaren“ Geweben ist relativ wenig über die Vm-Dynamik von Krebszellen bekannt. Hier zeigt die Hochdurchsatz-Vm-Bildgebung mit zellulärer Auflösung, dass Vm in mehreren Brustkrebszelllinien im Vergleich zu nicht krebsartigen MCF-10A-Zellen dynamisch schwankt. Wir charakterisieren Vm-Schwankungen von Hunderten von menschlichen dreifach negativen Brustkrebs-MDA-MB-231-Zellen. Durch die Quantifizierung ihrer dynamischen elektrischen Signaturen (DESs) durch ein unbeaufsichtigtes maschinelles Lernprotokoll identifizieren wir vier Klassen, die von „laut“ bis „blinken/winken“ reichen. Die Vm von MDA-MB-231-Zellen weisen spontane, vorübergehende Hyperpolarisationen auf, die durch die gehemmt werden Der spannungsgesteuerte Natriumkanalblocker Tetrodotoxin und die kalziumaktivierten Kaliumkanalinhibitoren Apamin und Iberiotoxin. Die Vm von MCF-10A-Zellen ist vergleichsweise statisch, aber die Fluktuationen nehmen nach der Behandlung mit dem transformierenden Wachstumsfaktor β1 zu, einem kanonischen Induktor der Epithel- zum mesenchymalen Übergang. Diese Daten legen nahe, dass die Fähigkeit, Vm-Fluktuationen zu erzeugen, eine Eigenschaft hybrider epithelial-mesenchymaler Zellen oder solcher sein könnte, die von luminalen Vorläuferzellen stammen.

Alle Zellen im Körper weisen eine Spannungsdifferenz (Vm) über die Plasmamembran auf, die eine Vielzahl von Funktionen wie Genexpression, Sekretion und Ganzzellmotilität reguliert. Die zelluläre Vm im Ruhezustand variiert sowohl zwischen als auch innerhalb der Zelltypen. Interessanterweise ist dies zwar ca. In reifen „ruhenden“ Zellen, einschließlich Nerven und Muskeln, liegt der Wert bei −70 mV, in proliferierenden Zellen, einschließlich Krebszellen und Stammzellen, ist er deutlich depolarisiert (Vm ca. −50 bis −10 mV)1,2.

Vm schwankt sowohl spontan als auch als Reaktion auf Reize in klassisch erregbaren Geweben wie Herz, Muskel und Nerv, die die Erzeugung und Weiterleitung von Aktionspotentialen unterstützen, dramatisch. Es wurde gezeigt, dass die Ruhe-Vm verschiedener Zelltypen schwankt3. Dazu gehören Zellen mit rhythmischer Aktivität, z. B. Neuronen, die die Atmung4, die arterielle Gefäßbewegung5, biologische „Uhren“6 und den Schlaf7,8 steuern. Schwankungen von Vm manifestieren sich auch in pathophysiologischen Situationen wie Epilepsie und neuronaler Degeneration und können zu Netzwerkeffekten führen9,10.

Bei mehreren Karzinomen fördert die funktionelle Expression spannungsgesteuerter Natriumkanäle (VGSCs) den Metastasierungsprozess11. Durch die In-vitro-Behandlung von Karzinomzellen mit VGSC-Blockern wird die 3D-Invasion teilweise unterdrückt12,13. Der spezifischste Inhibitor von VGSCs ist Tetrodotoxin (TTX), das den Kanal blockiert, indem es an eine Stelle innerhalb der Kanalpore bindet, wenn sich der Kanal im offenen Zustand befindet14. TTX reduziert die Invasion in Karzinomzellen in vitro, und dieser Effekt wird durch die siRNA-Stummschaltung des VGSC Nav1.5 in vivo aufgehoben12,13,15,16. Gradek et al. haben kürzlich gezeigt, dass die Stummschaltung von SIK1 die Expression, Invasion und Expression von Nav1.5 und die Expression des mit dem Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT) assoziierten Transkriptionsfaktor SNAl117 induziert. Wie oben erwähnt, ist die stationäre Ruhe-Vm von menschlichen Brustkrebszellen im Vergleich zu normalen Epithelien jedoch stark depolarisiert18. Im Fall der MDA-MB-231-Zellen, die aus einem hochaggressiven dreifach negativen Brustkrebs (TNBC) stammen, liegt Vm zwischen –40 und –20 mV15,19,20. Die Vm-abhängige Inaktivierung von VGSCs bedeutet, dass die meisten Kanäle bei solchen depolarisierten Membranpotentialen dauerhaft inaktiviert und daher gegenüber TTX unempfindlich sein sollten. Dennoch wurde wiederholt gezeigt, dass TTX die Invasivität dieser Zellen und mehrerer anderer Karzinome hemmt11,15,19,21,22,23,24, möglicherweise durch Blockierung des persistenten Fensterstroms19,25.

Obwohl die Depolarisation von ruhendem Vm und die angereicherte VGSC-Expression in aggressiven Krebszelllinien nachgewiesen sind (Übersicht von Yang und Brackenbury2 sowie Pardo und Stühmer26), ist im Gegensatz zu klassischen erregbaren Geweben (z. B. Herz, Muskel, Nerv) vergleichsweise wenig über Krebs bekannt VM-Dynamik. Studien mit Mehrfachelektrodenarrays stellten Vm-Fluktuationen fest, konnten diese jedoch nicht einzelnen Zellen zuordnen27,28. Im Gegensatz dazu haben wir hier die zelluläre und ortsaufgelöste Vm-Dynamik in menschlichen Brustkrebszellen mit einem schnellen, elektrochromen spannungsempfindlichen Farbstoff erfasst und so die optische Überwachung von Vm-Änderungen in Hunderten von Zellen gleichzeitig ermöglicht. Durch ein unbeaufsichtigtes maschinelles Lernprotokoll haben wir die dynamischen elektrischen Signaturen (DESs) der zellulären Vm-Zeitreihen klassifiziert und charakterisiert, die mit Hochdurchsatz-Bildgebung erhalten wurden. Eine Untergruppe von MDA-MB-231-Brustkrebszellen zeigte hyperpolarisierende „Blitze“ und „Wellen“, im Gegensatz zum ruhenden, statischen Vm von nicht tumorerzeugenden MCF-10A-Zellen. Die Anwendung von TTX unterdrückte die Vm-Fluktuationen in MDA-MB-231-Zellen, während die Behandlung von MCF-10A-Zellen mit dem transformierenden Wachstumsfaktor β1 (TGF-β), der die EMT stimuliert, Vm-Fluktuationen in diesen Zellen induzierte. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Fähigkeit, Vm-Fluktuationen zu erzeugen, während der EMT erworben wird und möglicherweise am Fortschreiten des Krebses beteiligt ist.

Wir haben das Membranpotential kultivierter Zellmonoschichten mit extrazellulär aufgetragenem di-4-AN(F)EP(F)PTEA abgebildet, einem Farbstoff, der sich in die äußere Membran einfügt und seine Absorptions- und Emissionsspektren als Funktion des Membranpotentials mit sub- Zeittreue im Mikrosekundenbereich29. Wir haben den Farbstoff nacheinander mit blauen und grünen Leuchtdioden (LEDs, Abb. 1a, b und S1) angeregt, indem wir das Verhältnis der von jeder Farbe zu jedem Zeitpunkt angeregten Fluoreszenz genommen und durch das Basislinienverhältnis (ΔR/R0) dividiert haben. . Eine Änderung von Vm führt dazu, dass sich die von jeder Farbe angeregte Fluoreszenz in entgegengesetzte Richtungen ändert (Abb. 1c), wodurch die entsprechende Änderung des Verhältnisses verstärkt wird. Das ratiometrische Bildgebungsschema mildert teilweise auch die Störungen durch ungleichmäßige Farbstoffmarkierung, Photobleichzerfall und mechanische Bewegung30. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, die Dynamik von Hunderten menschlicher Brustkrebszellen gleichzeitig mit zellulärer Auflösung abzubilden.

a Schematische Darstellung des Weitfeld-Epifluoreszenz-Bildgebungssystems mit Zweifarbenanregung. b MDA-MB-231-Zelle, gefärbt mit di-4-AN(F)EP(F)PTEA mit gleichzeitiger Spannungsklemme. c Die blauen und roten Linien zeigen die Anregungs- und Emissionsspektren von di-4-AN(F)EP(F)PTEA29 , jeweils. Die Fluoreszenz wird durch blaue und grüne LEDs auf gegenüberliegenden Seiten des Anregungsmaximums angeregt (schwarze vertikale gestrichelte Linien). Eine Verringerung oder Erhöhung von Vm führt dazu, dass sich die Anregungsspektren nach rechts bzw. links verschieben. Eine Verringerung von Vm führt daher zu einer verringerten Emission als Reaktion auf die Anregung des blauen Kanals und zu einer erhöhten Fluoreszenz bei Anregung des grünen Kanals und umgekehrt bei zunehmender Vm. d Wellenformen, die die Ganzzellspannungsklemme MDA-MB-231 zur Kalibrierung des Verhältnisses von blauer zu grün angeregter Fluoreszenz in Bezug auf die Basislinie (ΔR/R0) steuern. e Aufgezeichnetes ΔR/R0-Signal als Reaktion auf die injizierten Vm-Wellenformen. f Durchschnittliche ΔR/R0-Änderung mit Membranspannungsänderung und eine lineare Anpassung an die Daten, die die Bildempfindlichkeit angeben (prozentuale Änderung des Verhältnisses pro 100 mV Membranspannungsänderung). g Gemessene Empfindlichkeiten für verschiedene gepatchte Zellen mit einer Gaußschen Kernelschätzung (blaue Hülle). h Beispielhafter Zeitverlauf einer spontan aktiven MDA-MB-231-Zelle, die typischerweise beobachtete vorübergehende Vm-Hyperpolarisationen zeigt (angezeigt durch rote Häkchen). Grau, ungefilterter Zeitverlauf, schwarz, Gauß-gefilterter Zeitverlauf, Sigma = 3 Abtastpunkte (0,6 s).

Wir haben zunächst überprüft, dass das Fluoreszenzverhältnis (ΔR/R0) lineare Änderungen in Vm anzeigt. Durch die Abbildung der Di-4-AN(F)EP(F)PTEA-Fluoreszenz, während Vm durch einen Wertebereich in der Ganzzellspannungsklemme von MDA-MB-231-Zellen schrittweise durchlaufen wurde, beobachteten wir, dass das Verhältnis von Blau zu Grün Die Di-4-AN(F)EP(F)PTEA-Fluoreszenz variierte linear mit Änderungen in Vm über einen physiologischen Vm-Bereich von –60 bis +30 mV. Die Steigung von ΔR/R0 vs. Vm zeigte eine durchschnittliche Empfindlichkeit von 5,1 ± 0,43 % pro 100 mV (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM); n = 12 Zellen; Abb. 1d – g). Darüber hinaus erhöhte erwartungsgemäß auch die globale Depolarisation aller Zellen auf dem Deckglas durch Waschen in einer extrazellulären Lösung mit hohem Kaliumgehalt (100 mM) ΔR/R0 (Abb. S2). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verhältnis ΔR/R0 Vm-Änderungen in nachfolgenden Aufzeichnungen spontaner Vm-Schwankungen zuverlässig wiedergibt (Abb. 1h).

Wir verglichen die Häufigkeit optisch erkannter, vorübergehender, negativ verlaufender Ereignisse („−VEs“) in nicht tumorerzeugenden MCF-10A-Zellen mit der von acht menschlichen Brustkrebszelllinien: MDA-MB-231, MDA-MB-468, Cal-51, SUM-159, Hs578T, MDA-MB-453 und BT-474 sowie T-47D. Abbildung 2 zeigt die Rate der −VEs für jedes abgebildete Sichtfeld. Alle Krebszelllinien weisen eine deutlich höhere −VE-Rate auf als die gutartige MCF-10A-Brustepithellinie: MDA-MB-231 (p = 1,4 × 10−8), MDA-MB-468 (p = 1,1 ×). 10−8), Cal-51 (p = 1,1 × 10−5), SUM-159 (p = 3,4 × 10−3), Hs578T (p = 5,7 × 10−6), MDA-MB-453 (p = 5,2 × 10−5), BT-474 (p = 2,2 × 10−11) und T-47D (p = 0,01). Die p-Werte dienen dem Vergleich der durchschnittlichen „−VE“-Rate negativer Ereignisse pro Sichtfeld für jede Krebszelllinie im Vergleich zur nicht tumorigenen MCF-10A-Linie unter Verwendung eines Mann-Whitney-U-Tests mit Benjamini-Hochberg Korrektur für Mehrfachvergleiche (Falscherkennungsrate = 0,05). Bemerkenswerterweise korrelierte das Ausmaß der Aktivität stark mit dem Linienuntertyp. Krebslinien, die zuvor als Luminal B (BT-474, MDA-MB-453) oder Basal A (MDA-MB-468) klassifiziert wurden, waren die aktivsten31 (Abb. 2). Doch während die Linien Luminal A und Basal B weniger aktiv waren als die Linien Luminal B oder Basal A, waren sie dennoch deutlich aktiver als nicht transformierte Zellen.

Jeder Kreis gibt die mittlere negative Ereignisrate „−VE“ (pro Zelle, pro 1000 s) für alle Zellen im Sichtfeld eines Bildgebungsversuchs an. Alle Krebszelllinien weisen eine −VE-Rate auf, die deutlich höher ist als die der gutartigen MCF-10A-Brustepithellinie (alle p-Werte ≤ 0,01). Die p-Werte dienen dem Vergleich des Durchschnitts pro Sichtfeld − VE-Rate für jede Krebszelllinie im Vergleich zur nicht krebsartigen MCF-10A-Linie unter Verwendung eines Mann-Whitney-U-Tests mit Benjamini-Hochberg-Korrektur für mehrere Vergleiche (Falscherkennungsrate = 0,05).

Die folgenden Abschnitte charakterisieren optisch die Vm-Dynamik von MDA-MB-231, einem umfassend untersuchten Modell für metastasierten, dreifach negativen Brustkrebs.

Eine Untergruppe von MDA-MB-231-Zellen zeigte schwankende Vm. Wir haben spontane Vm-Fluktuationen mit 5 Bildern/s in kultivierten Monoschichten der hochaggressiven dreifach-negativen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 abgebildet (Abb. 3a). 6,84 ± 0,97 % (n = 22 Deckgläser) der Zellen auf jedem Deckglas zeigten ein schwankendes Vm (Abb. 3b, c). Die große Mehrheit (>90 %, 91/100) der Ereignisse mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis und großer Amplitude (>∣1,5 %∣ΔR/R0) war negativ („−VE“, Abb. 3b). Daher konzentrieren sich nachfolgende Analysen auf die −VEs (Abb. 2a, b). Die meisten Zellen zeigten nur wenige oder keine Schwankungen, aber eine Untergruppe der Zellen war sehr aktiv (Abb. 3c, siehe auch Zusatzfilm 1). Unter den aktiven Zellen wurden Ereignisse mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von 2 ± 0,2 Ereignissen/Zelle/1000 s erkannt (n = 20 Deckgläser, Abb. 3d).

a Das Verhältnis der Di-4-AN(F)EP(F)PTEA-Fluoreszenz (ΔR/R0) wurde mit 5 Bildern/s in kultivierten MDA-MB-231-Zellen abgebildet. Die aus den segmentierten Zellen (rechts) extrahierte ΔR/R0-Zeitreihe zeigt heterogene Vm-Fluktuationen, die hauptsächlich aus vorübergehenden Hyperpolarisationen bestehen. b Ein logarithmisch skaliertes 2D-Histogramm der Ereignisamplitude und -dauer. Diese Schwankungen variieren in ihrer Polarität (positiv, „+VE“ vs. negativ, „−VE“), Amplitude und Dauer. Große Amplitudenschwankungen waren typischerweise hyperpolarisierend (−VE-Amplitude) und von kurzer Dauer. c Anteil aktiver Zellen für 20 technische Replikate, die eine hohe Variabilität im Anteil aktiver Zellen zeigen. d Ein logarithmisch skaliertes Histogramm der mittleren −VE-Rate für alle aktiven Zellen (mindestens eine −VE beobachtet), das die Long-Tailed-Verteilung mit einigen wenigen hochaktiven Zellen zeigt.

Anschließend versuchten wir, die „dynamische elektrische Signatur“ (DES) einzelner Zellen auf der Grundlage ihrer Vm-Bildgebungszeitreihe zu beschreiben. Ein DES ist ein multiparametrischer Merkmalsvektor, der verschiedene Aspekte von Vm-Schwankungen über die Zeit, wie z. B. spektrale Leistungseigenschaften, nacheinander erfasst Unterschiede und Entropie. Ein DES erfasst Variationen über die ereignisbasierten Metriken hinaus und kann zur Klassifizierung von Mustern basierend auf ihrer Ähnlichkeit verwendet werden. Um die DESs zu beschreiben, haben wir eine unbeaufsichtigte Pipeline für maschinelles Lernen implementiert (Abb. 4). Die Cellular DES-Pipeline verwendet der Catch-22-Algorithmus32 zum Extrahieren von Merkmalen aus einzelnen Vm-Spuren. Merkmalsextraktion und hierarchisches Clustering in den „aktiven“ zellulären Zeitreihen, in denen Vm-Fluktuationen erkannt wurden (287 von 2993, Abb. 4a – c), ergaben Silhouettenkoeffizienten Dies zeigt an, dass die Zeitreihe in 3 oder 4 Klassen gruppiert ist (Abb. 4d). Die manuelle Untersuchung der Zeitreihe ergab einen höheren inneren Cluster, ähnlich wie bei 4 Clustern. Wir haben die DES-Klassen benannt, die durch die 4-Cluster-Klassifizierung identifiziert werden: kleines Blinken (Blinken-S), winkendes, lautes Blinken und großes Blinken (Blinken-L). Abbildung 5 zeigt beispielhafte Zeitreihen für jede Klasse. Zellen der vier Klassen wurden gleichzeitig in den abgebildeten Sichtfeldern (FOVs) beobachtet. Zusammen beschreiben diese vier DES-Klassen die zeitliche Heterogenität von Vm-Fluktuationen in MDA-MB-231-Zellen.

a Zeitreihen wurden in die Clustering-Pipeline für unbeaufsichtigtes maschinelles Lernen aufgenommen, wenn ihr zeitlich gefiltertes ΔR/R0 Schwankungen > 2,5 × ihrer Pixelstandardabweichung innerhalb des ROI vom mittleren Pixelwert aufwies und wenn sie außerdem frei von Bildartefakten, einschließlich schwebendem Staub, mechanisch waren Vibration und Randbeleuchtungseffekte. b Durch eine visuelle Prüfung der Zeitreihen jeder Zelle wurde die Aufnahme in die zelluläre DES-Pipeline abgeschlossen. c 22 Merkmale, die für Zeitreihen-Zeitmuster relevant sind, wurden aus jeder Zeitreihe mit dem Catch-22-Algorithmus32 extrahiert und mit einer Box-Cox-Transformation relativ zu ihren Werten normalisiert. d Die Silhouette-Koeffizienten für verschiedene Clusterzahlen wurden durch hierarchisches Clustering (blau) oder Gaußsche Mischungsmodellierung (GMM, orange) auf den normalisierten Merkmalen generiert.

Repräsentative Zeitreihen wurden ausgewählt, indem die Werte der in die Richtung jedes Typs weisenden Merkmale im 2D-PC-Raum sortiert wurden.

Um die Rolle der VGSC-Aktivität im DES von MDA-MB-231-Zellen zu beurteilen, behandelten wir Kulturen mit Tetrodotoxin (TTX), einem wirksamen und spezifischen Inhibitor von VGSCs14. Die Fähigkeit elektrochromer Farbstoffe, die Wirkung von TTX zu melden, ist gut belegt33. TTX verringerte dosisabhängig die Häufigkeit von Vm-Schwankungen, insbesondere von Hyperpolarisationen mit großer Amplitude (−VEs, Abb. 6a, b). Insbesondere verringerte 10 μM TTX die mittlere Ereignisrate um etwa das Vierfache von 9,5 × 10–5 auf 1,97 × 10–5 Ereignisse/Zelle/s (p < 10–6, einseitiger Bootstrapping-Signifikanztest für den Mittelwert negativ). Ereignisrate pro Zelle; vor TTX n = 1063 Zellen, 4 Slips; mit TTX n = 2028 Zellen, 4 Slips; Abb. 6c). 1 μM TTX verringerte die mittlere Ereignisrate um einen geringeren Faktor von ~ 2×, von 1,04 × 10–4 auf 4,99 × 10–5 Ereignisse/Zelle/s (p = 0,019, einseitiger Bootstrapping-Signifikanztest für das mittlere negative Ereignis). Rate pro Zelle; vor TTX n = 519 Zellen, 2 Belege; mit TTX n = 722 Zellen, 2 Belege; Abb. 6d). Die Wirkung von TTX auf die Ereignishäufigkeit erholte sich nach dem Auswaschen (10 μM TTX; vor TTX n = 486 Zellen, 3 Slips; mit TTX n = 1066 Zellen, 3 Slips; Auswaschen n = 1005 Zellen, 3 Slips; Abb. 6e). Für die merkmalsbasierte Analyse ergab die Projektion aktiver TTX-behandelter MDA-MB-231-Zellen auf den Hauptkomponentenraum (PC) der aktiven unbehandelten Zellen keine DES-Klassendifferenzierung mit TTX (Abb. S3).

ai, ii Beispiel-Vm-Zeitverläufe der 8 aktivsten Zellen in Akquisitionen vor (ai) und mit (aii) 10 μM TTX. bi, bii Logarithmisch skalierte 2D-Histogramme erkannter Ereignisse vor (bi) und mit (bii) 10 μM TTX. TTX eliminiert praktisch alle großen, hyperpolarisierenden Ereignisse (−VEs, gestrichelter oranger Umriss). c Logarithmisch skalierte Histogramme der −VE-Ereignisrate pro Zelle vor und nach der Anwendung von 10 μM TTX. Die Verringerung des Mittelwerts von 9,5 × 10–5 Ereignissen/Zelle/s auf 1,97 × 10–5 Ereignisse/Zelle/s (ca. 4-fache Abnahme) ist bei p < 10–6 signifikant. d Die Wirkung von TTX ist dosisabhängig: 1 μM TTX reduzierte die mittlere Ereignisrate um einen geringeren Faktor von ~2× von 1,04 × 10–4 Ereignissen/Zelle/s auf 4,99 × 10–5 Ereignisse/Zelle/s (S = 0,019). e Die Wirkung von TTX ist reversibel. Die Wirkung von TTX kann durch Auswaschen des Toxins umgekehrt werden, wodurch die −VE-Rate deutlich erhöht wird.

Wir untersuchten, ob kalziumaktivierte Kaliumkanäle (KCa) eine Rolle bei der Umwandlung von Kalziumschwankungen in optisch gemessene Vm-Schwankungen spielen. Wir behandelten Kulturen entweder mit 100 nM Iberiotoxin (IbTx), einem KCa-Kanalblocker (BK) mit großer Leitfähigkeit, oder 100 nM Apamin, einem KCa-Kanalblocker (SK) mit kleiner Leitfähigkeit. Sowohl IbTx als auch Apamin verringerten die Häufigkeit von −VEs um etwa das Fünffache (Abb. 7). 100 nM IbTx senkte die mittlere −VE-Rate von 11,1 × 10–5 auf 1,94 × 10–5 Ereignisse/Zelle/s (p < 10–6, einseitiger Bootstrapping-Signifikanztest auf die mittlere negative Ereignisrate pro Zelle; vor n = 2761 Zellen, 6 Belege; mit IbTx n = 1599 Zellen, 6 Belege). 100 nM Apamin senkte die mittlere −VE-Rate von 10,9 × 10–5 auf 1,89 × 10–5 Ereignisse/Zelle/s (p < 10–6, einseitiger Bootstrapping-Signifikanztest auf die mittlere −VE-Rate pro Zelle; vor nM = 3110, 6 Belege; mit Apamin n = 2223, 5 Belege). Separate Bildgebungssitzungen von MDA-MB-231-Zellen, in denen IbTx und Apamin nach 45–60-minütiger Anwendung ausgewaschen wurden, zeigten −VE-Raten, die mit den Aufzeichnungen vor IbTx und vor Apamin vergleichbar waren. Nach dem Auswaschen von 100 nM IbTx betrug die mittlere −VE-Rate 18,6 × 10−5 Ereignisse/Zelle/s (p = 0,997, zweiseitiger Bootstrapping-Signifikanztest für die mittlere −VE-Rate im Vergleich zu Prä-Apamin-Versuchen, Auswaschen n = 817 Zellen, 1 Slip). Nach dem Auswaschen von 100 nM Apamin betrug die mittlere −VE-Rate 15,8 × 10−5 Ereignisse/Zelle/s (p = 0,934, zweiseitiger Bootstrapping-Signifikanztest für die mittlere −VE-Rate im Vergleich zu Prä-Apamin-Versuchen; Auswaschen n = 1379 Zellen, 1 Slip). Somit waren die Wirkungen der KCa-Kanalblocker reversibel.

ai, aii Beispiel Vm-Zeitverläufe von den 8 aktivsten Zellen in einer Aufnahme vor (ai) und mit (aii) 100 nM IbTx. b, c Logarithmisch skalierte 2D-Histogramme der Amplitude und Dauer erkannter Ereignisse vor (oben) und mit (unten) 100 nM IbTx (links) und 100 nM Apamin (rechts). d, e Log-skalierte Histogramme der −VE-Ereignisrate pro Zelle vor und nach der Anwendung von 100 nM IbTx (links) und 100 nM Apamin (rechts).

Um den Einfluss des krebsartigen, aggressiven Phänotyps von MDA-MB-231 auf die Vm-Dynamik zu beurteilen, verglichen wir ihn mit der Vm-Dynamik nicht-tumorigener MCF-10A-Zellen (Abb. 8a, c). Unter Anwendung des gleichen Bildgebungsprotokolls beobachteten wir, dass nur eine kleine Teilmenge (0,46 % ± 0,14 %, n = 6944 Zellen, 12 Deckgläser) der MCF-10A-Zellen Vm-Schwankungen im Vergleich zu MDA-MB-231-Zellen (6,84 % ± 0,97 %) aufwiesen. , n = 3017 Zellen, 13 Deckgläser, Abb. 8e). Interessanterweise erhöhte die Inkubation der Zellen mit TGF-β1 (5 ng/ml), einem Wachstumsfaktor, von dem bekannt ist, dass er EMT34 stimuliert, den Prozentsatz der Zellen, die Vm-Schwankungen aufwiesen, auf 0,81 ± 0,19 % (n = 3787 Zellen, 13 Deckgläser, Abb. 8b). , D). Mit TGF-β stieg die mittlere −VE-Rate von 2,85 × 10–6 auf 1,4 × 10–5 Ereignisse/Zelle/s (p = 0,000567, einseitige Bootstrap-Differenz der Mittelwerte auf Zellebene, Abb. 8c–e ).

a, b Bilder und zelluläre Vm-Zeitreihen, extrahiert aus MCF-10A-Zellen (a) und mit TGF-β behandeltem MCF-10A (b). c, d 2D-logarithmisch skalierte Amplituden-Dauer-Histogramme von c MCF-10A- und d MCF-10A+TGF-β-Ereignissen. Sowohl MCF-10A als auch MCF-10A+TGF-β weisen deutlich niedrigere Ereignisraten auf als MDA-MB-231-Zellen. e Vergleich der negativen Ereignisrate auf Zellebene. Die Inkubation von Zellen mit TGF-β erhöht die Ereignisrate deutlich. f Die Inkubation von MCF-10A in TGF-β verändert das DES auf zellulärer Ebene. Die behandelten und unbehandelten Zellen befinden sich in unterschiedlichen Bereichen des 2D-PC-Raums, was auf eine DES-Differenzierung zwischen diesen Gruppen hinweist. Die schwarze gestrichelte Linie ist der beste lineare Separator, der für die mit TGF-β behandelten (orange) und unbehandelten (blau) Gruppen berechnet wurde. g Im Gegensatz zum unbehandelten MCF-10A, das Vm-Fluktuationen unterschiedlicher Amplitude aufwies, beeinflusste die TGF-β-Behandlung die aktiven MCF-10A-Vm-Fluktuationen so, dass sie sich in der Nähe der „winkenden“ MDA-MB-231-Klasse mit großer Amplitude im kombinierten PC-Raum lokalisierten.

Die Visualisierung der normalisierten Merkmale der MCF-10A-Zellen im 2D-PC-Raum zeigt die Trennung der DESs zwischen TGF-β-behandelten und unbehandelten MCF-10A-Zellen (Abb. 8f). Insbesondere 7/27 unbehandelte MCF-10A-Zellen und 9/33 TGF-β-behandelte MCF-10A-Zellen lagen außerhalb der Entscheidungsgrenze des besten linearen Separators (Abb. 8f, gestrichelte Linie). In einem Merkmalsraum, der MDA-MB-231-DESs und MCF-10A-DESs kombiniert, waren die MCF-10A-DESs über eine Reihe von MDA-MB-231-DES-Klassen im 2D-PC-Raum kolokalisiert, während die TGF-β-Behandlung die Lokalisierung mit großem Abstand steigerte -Amplitude Vm „winkende“ MDA-MB-231-Zellen im kombinierten PC-Raum (Abb. 8g). Zusammenfassend erhöhte die TGF-β-Behandlung die Ähnlichkeit der MCF-10A-Vm-Dynamik mit dem „winkenden“ MDA-MB mit großer Amplitude -231 DES-Klasse. Somit korreliert die mesenchymale Differenzierung mit erhöhten Vm-Fluktuationen.

Wir beobachteten zeitliche Korrelationen zwischen Ereignissen, die in gleichzeitig abgebildeten MDA-MB-231-Zellen auftraten. Der paarweise Vergleich zellulärer Vm-Zeitreihen ergab eine Mischung aus synchronen und asynchronen Ereignissen (Abb. 9a), was darauf hinweist, dass diese zeitlichen Korrelationen nicht durch optisches Übersprechen verursacht wurden. Um zu beurteilen, ob die zeitlichen Korrelationen der Vm-Ereignisse mit deutlich über dem Zufall liegenden Raten auftraten, haben wir Ereignisraster für Vm-Transienten generiert, die in Zeitintervallen von 1 bis 100 s erkannt wurden (Abb. 9b zeigt 10-s-Intervalle). Anschließend haben wir den paarweisen Pearson-Korrelationskoeffizienten (PCC) für alle Zellen in jedem FOV berechnet. Wir haben den mittleren PCC für die Zellen mit dem PCC von zufällig gemischten Rastern verglichen, wodurch die zellulären Ereignisstatistiken erhalten blieben, aber alle zeitlichen Korrelationen zwischen Zellen zerstört wurden. Der PCC nahm erwartungsgemäß insgesamt mit der Bin-Größe zu, und der PCC für die echten Ereignisraster war für alle Bin-Größen deutlich größer als der PCC der verschlüsselten Raster (Abb. 9c). Dieses Ergebnis weist auf eine signifikante zeitliche Korrelation zwischen Zellen von MDA-MB-231-Vm-Ereignissen hin, die über dem liegt, was zufällig für solche zeitlich zufällig verteilten Ereignisse beobachtet werden würde.

ein Beispiel für zeitlich korrelierte zelluläre Zeitverläufe aus einem FOV. Räumlich getrennte Zellen (0,1,2) und (3,4,5) zeigen synchronisierte Hyperpolarisationen. Wichtig ist, dass diese Synchronisationen in verschiedenen Untergruppen der Gruppen und in räumlich getrennten Zellen auftreten, was darauf hindeutet, dass die Synchronisation nicht einfach auf Übersprechen in der Bildgebung zurückzuführen ist. b Quantifizierung der Korrelation. Ereignisse werden in Zeitintervalle eingeordnet, wodurch zellulare Ereignisraster generiert werden. Die durchschnittliche paarweise Korrelation zwischen Zellen in einer Aufzeichnung wurde berechnet. Durch zeitliches Mischen des Ereignisrasters jeder Zelle wurde eine Nullhypothese einer Nullkorrelation mit denselben zeitlichen Statistiken erstellt, um eine Schätzung des erwarteten Korrelationsgrads zu erhalten, wenn keine zelluläre Synchronisierung vorhanden wäre. c Die beobachteten paarweisen Korrelationen sind in den beobachteten Daten deutlich höher als in den gemischten Daten für alle Behältergrößen, was darauf hindeutet, dass die Zellaktivität zeitlich korreliert. Die Punkte stellen den Mittelwert dar und die Balken geben das 95 %-Konfidenzintervall für den gemessenen und gemischten Fall für jede Klassengröße an.

In einem Fall beobachteten wir eine Welle vorübergehender Depolarisationen, die sich durch eine Untergruppe von Zellen unidirektional über das Sichtfeld ausbreitete (Abb. 10). Die Steigung der an den Abstand angepassten Linie als Funktion der Hyperpolarisationsspitzenzeit von der ersten aktiven Zelle zeigt eine Ausbreitungsgeschwindigkeit von 27 μm/s (Abb. 10b, Zusatzfilm 2).

a Zeigt zelluläre ROIs und ihre farblich entsprechenden ΔR/R0-Zeitreihen (rechts). b Stellt den Abstand von der ersten Zelle als Funktion der Zeit bei maximaler Hyperpolarisation dar. Die Linienanpassung an diese Beziehung zeigt eine Ausbreitungsgeschwindigkeit von 27 μm/s. c Stellt die maximale transiente Amplitude (%ΔR/R0) als Funktion des Abstands von der Zelle dar, die zuerst die transiente Hyperpolarisation zeigt.

Die hochauflösenden Bildgebungsdaten mit hoher Gesamtauflösung deuten darauf hin, dass Vm in Subpopulationen hochaggressiver Brustkrebszelllinien dynamisch schwankt. Sowohl die ereignisbasierte als auch die merkmalsbasierte Analyse zeigten, dass die stereotypischsten dieser Ereignisse in MDA-MB-231-Zellen vorübergehende hyperpolarisierende „Blinker“ und „Wellen“ waren. Diese Ereignisse wiesen eine signifikante interzelluläre zeitliche Korrelation auf. Die Anwendung des VGSC-Blockers TTX und zweier KCa-Inhibitoren, IbTx und Apamin, verringerte die dynamische Vm-Aktivität in MDA-MB-231-Zellen erheblich. Der Vm von nicht krebsartigen MCF-10A-Brustepithelzellen war im Vergleich zu dem von MDA-MB-231-Zellen statisch. Die Behandlung von MCF-10A-Zellen mit TGF-β erhöhte die Vm-Fluktuationen und erhöhte die merkmalsbasierte Ähnlichkeit ihrer zeitlichen Fluktuationen mit denen von MDA-MB-231-Zellen.

Die Ganzzellen-Patchklemme ist der Goldstandard für die absolute Vm-Messung. Mit dieser Technik wurde gemessen, dass die stationäre Ruhe-Vm von menschlichen Brustkrebszellen im Vergleich zu normalen Epithelien stark depolarisiert ist15,18,19,20. Über die spontane Vm-Dynamik in menschlichen Brustzellen wurde jedoch relativ wenig berichtet. Die Ganzzellen-Stromzange könnte prinzipiell Vm-Schwankungen erkennen, aber darüber wurde bisher nicht berichtet. Es ist möglich, dass die Dialyse des intrazellulären Raums durch die Patchpipette die molekulare Maschinerie, die den Vm-Schwankungen zugrunde liegt, auswäscht oder dämpft. Darüber hinaus könnte der geringe Durchsatz der Patch-Clamp-Aufzeichnung die Erkennung der heterogenen DESs behindern, die nur etwa 1 von 20 Zellen aufweisen.

Unsere Erkennung von Vm-Schwankungen in Untergruppen von Brustkrebs- und MCF-10A-Zellen wurde durch die Anwendung und Anpassung der elektrochromen Spannungsfarbstoffbildgebung ermöglicht. Entscheidend ist, dass unser Ansatz die gleichzeitige Überwachung spontaner Vm-Schwankungen in Hunderten von Zellen mit Einzelzellauflösung ermöglichte. Elektrochrome Farbstoffe verfolgen Vm mit einer zeitlichen Genauigkeit im Submikrosekundenbereich35, sind aber auch phototoxisch, was die Belichtungsdauer, -rate und die gesamte Bildgebungszeit begrenzt (in unserem Fall 3 ms Belichtungen bei 5 Hz über 920 s). Zukünftig könnte der Einsatz von Sonden, die auf anderen Mechanismen wie dem fotoinduzierten Elektronentransfer36 oder der Transfektion mit genetisch kodierten Spannungsindikatoren (GEVIs) auf der Basis fluoreszierender Proteine ​​basieren37, die Gesamtbildgebungszeit und/oder -rate erhöhen. Im Fall von GEVIs wird das Photonenbudget jedoch häufig durch Photobleichung begrenzt, ein Problem, das durch chemigenetische Sensoren angegangen wird38. Unser ratiometrisches Anregungsschema reduzierte Bildartefakte aufgrund von Photobleichung sowie Konzentrations- und Volumenschwankungen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Spannungsfarbstoffintensität relative Änderungen in Vm und nicht absolute Vm anzeigt. Eine zweite Einschränkung unserer Analyse besteht darin, dass wir zur Beseitigung der Auswirkungen von Bleichung und Zellbewegung unsere Vm-Spuren vor der Analyse durch Division durch den gleitenden 1000-Punkte-Durchschnitt des Zeitverlaufs zeitlich hochpassfiltern. Dieser Filter verhinderte die Erkennung von Aktivitäten, die auf Zeitskalen von weniger als etwa 0,01 Hz schwankten.

Eine bemerkenswerte Beobachtung ist, dass alle Brustkrebslinien unter normalen Bedingungen Vm-Schwankungen aufwiesen, MDA-MB-453, MDA-MB-468 und BT-474 jedoch deutlich aktiver waren, gemessen an der Häufigkeit negativer Ereignisse (Abb. 2). BT-474 und MDA-MB-453 wurden zuvor als Luminal-Subtypen charakterisiert, während MDA-MB-468 Basal-A39-Subtypen sind. Es wird angenommen, dass luminale Vorläuferzellen in der Brustdrüse die Ursprungszelle für luminale Krebs-Subtypen sind40. Es ist verlockend zu spekulieren, dass erhöhte Vm-Fluktuationen eine inhärente Eigenschaft dieser Vorläufer und/oder ihrer transformierten Derivate sein könnten. Luminal-Vorläufer können auch zu Basalkrebs führen, und tatsächlich sind insbesondere viele Basal-A-Linien den Luminal-Linien insofern sehr ähnlich, als sie epitheliale Eigenschaften aufweisen und ähnliche Mutations- oder Expressionsprofile wie die BRCA1-Luminallinien aufweisen39,41,42,43. Daher könnte die hohe Häufigkeit von Vm-Fluktuationen in MDA-MB-468 darauf hindeuten, dass sie ebenfalls von einem luminalen Vorläufer stammen; im Gegensatz zu anderen Basallinien (z. B. MDA-MB-231), die wir untersucht haben. Tatsächlich haben frühere Studien morphologische Ähnlichkeiten zwischen MDA-MB-468 und MDA-MB-453 festgestellt, da sie als „traubenartige“ Kolonien in 2D- und 3D-Matrizen wachsen, was eine schwache epitheliale Anhaftung widerspiegelt44. Tatsächlich handelt es sich um einen Zustand schwacher Anhaftung, Wenn Zellen in einer Zwischenform zwischen epithelialer und mesenchymaler Form oder in einem „hybriden E/M“-Zustand vorliegen45, kann dies mit einer erhöhten Vm-Aktivität korrelieren oder diese sogar begünstigen. Tatsächlich beobachteten wir die Induktion von EMT durch TGF-β von normalem MCF- 10A-Epithelzellen führten zu einem Anstieg der Vm-Fluktuationen (Abb. 8). Interessanterweise wurde zuvor gezeigt, dass die Behandlung mit TGF-β auch die VGSC-Expression in MCF-10A-Zellen erhöht17. Möglicherweise behalten Zellen in diesem Hybridzustand Strukturen wie Gap Junctions bei46, Dies könnte den Ionenaustausch erleichtern und gleichzeitig die Zell-Zell-Adhäsion herunterregulieren (dh unter Einbeziehung von Cadherinen).

In MDA-MB-231-Zellen wurde kürzlich ein TTX-empfindlicher Vi-Phänotyp mit Spikes durch die extrazelluläre Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnung (MEA) beschrieben28. In dieser Studie aggregierte jede großflächige (2 mm2) Elektrode Signale von 100 s Zellen und ermöglichte so die Erkennung seltener Spike-Ereignisse in gepoolten Populationen. Während unsere 5-Hz-Bildgebungsrate die in dieser Studie beschriebene „schnell ansteigende“ (10 s Millisekunden dauernde) Aktivität nicht erfassen konnte, ist es möglich, dass die von den Autoren festgestellten „quadratischen“ Impulse (bis zu 7 s dauern) auftreten aus der gleichen Vm-Dynamik, die in unserer Vm-Bildserie als Blinken/Wellen gemeldet wurde. Unsere Bildgebungsmethode ergänzt hochzeitlich aufgelöste MEA-Aufzeichnungen, indem sie eine zellularaufgelöste Lokalisierung von Vm-Fluktuationen mit hohem Durchsatz ermöglicht, die zur Erkennung räumlich-zeitlicher Muster erforderlich ist, z. B. der interzellulären Vm-Wellenausbreitung (Abb. 10). Der hier demonstrierte hohe Durchsatz der Vm-Bildgebung öffnet ein neues Fenster zur „elektroerregbaren“ Pathophysiologie von Krebs.

Ungefähr 7 % der MDA-MB-231-Zellen zeigten vorübergehende Schwankungen in Vm. Die Ereignisse mit großer Amplitude waren hyperpolarisierende „Blitze“ und „Wellen“. Diese Beobachtung steht im krassen Gegensatz zu klassisch erregbaren Geweben wie Gehirn, Herz und Muskel, deren Ruhe-Vm nahe am Umkehrpotential für K+ liegt und die bei Erregung durch die Leitfähigkeit Na+ und/oder Ca2+ depolarisieren14. Ruhende MDA-MB-231-Zellen weisen ein relativ depolarisiertes Vm auf, was zumindest teilweise auf einen von Nav1.519,25,47 geleiteten Na+-„Fensterstrom“ zurückzuführen ist. Die großen negativ verlaufenden Ereignisse implizieren, dass die Leitfähigkeit von K+ (möglicherweise Cl−) vorübergehend zunimmt oder dass die Leitfähigkeit von Na+ vorübergehend abnimmt, wodurch Vm in Richtung des Nernst-Potentials von K+ hyperpolarisiert wird.

TTX reduzierte die Häufigkeit hyperpolarisierender transienter (−VE) in MDA-MB-231-Zellen signifikant. In Gegenwart von TTX hyperpolarisiert die Blockade anhaltender Na+-Ströme ruhendes Vm in MDA-MB-231-Zellen47. Eine ruhende Vm-Hyperpolarisation würde die treibende Kraft für die Leitfähigkeit des vorübergehenden hyperpolarisierenden Stroms verringern, was zumindest teilweise für die Verringerung der vorübergehenden Hyperpolarisationen verantwortlich sein könnte, die wir in Gegenwart von TTX festgestellt haben. Um die Kanäle und Ströme, die die hier beobachteten vorübergehenden Hyperpolarisationen vermitteln, vollständig aufzuklären, sind weitere Arbeiten z. B. mit pharmakologischen Wirkstoffen und Gen-Silencing mit gleichzeitigem Patch-Clamp erforderlich. Eine TTX-induzierte Hyperpolarisierung des Ruhemembranpotentials47 kann auch die Leitfähigkeit der spannungs- und Ca2+-aktivierten BK-Kanäle verringern. Tatsächlich impliziert die bei Apamin und IbTx beobachtete Verringerung der vorübergehenden Hyperpolarisationen, dass die spontanen Hyperpolarisationsereignisse über Ca2+-aktivierte K+-Kanäle mit Ca2+-Fluktuationen48 gekoppelt sein können. Zukünftige Studien können das Zusammenspiel zwischen Ca2+ und Vm durch gleichzeitige Kalzium- und Spannungsbildgebung sowie durch pharmakologische oder genetische Manipulation der KCa-Leitfähigkeit während der Vm-Bildgebung und Patch-Clamp weiter aufklären.

Ein wichtiger Unterschied zwischen unserer Vm-Bildgebungsstudie und früheren Patch-Clamp-Aufzeichnungen besteht darin, dass wir relative Änderungen in Vm und nicht absolute Vm melden. Tatsächlich sind die subtilen Änderungen des Ruhe-Vm um wenige Millivolt, die zuvor durch Patch-Clamp (z. B. Lit. 47) erfasst wurden, für unsere Bildgebungsmethode nicht sichtbar, nicht nur aufgrund der begrenzten Empfindlichkeit, sondern auch aufgrund der fehlenden Möglichkeit, Vm auf einer absoluten Spannungsskala zu kalibrieren basierend auf der Fluoreszenzintensität, sogar Intensitätsverhältnisse. Das vorherige Patch-Clamp-Verfahren und unsere schnellen Vm-Bildgebungsstudien mit hohem Durchsatz erzeugen daher komplementäre Daten, für deren Verknüpfung weitere Arbeiten erforderlich sind. Beispielsweise könnte man erwarten, dass die treibende Kraft für vorübergehende K+-vermittelte Hyperpolarisationen für einzelne Zellen mit der am stärksten depolarisierten Ruhe-Vm größer ist. Um diese Vorhersage zu testen, ist die Messung des absoluten Vm erforderlich. Zusätzlich zum Patch-Clamp kann die absolute Vm-Messung optisch durch Vm-Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung (VF-FLIM)49,50 realisiert werden. Aktuelle VF-FLIM-Implementierungen haben jedoch eine zeitliche Auflösung < 0,5 Hz und sind daher nicht in der Lage, die hier beschriebenen schnellen Schwankungen zu verfolgen.

Die Heterogenität der Vm-Schwankungen stimmt mit der heterogenen VGSC-Expression in MDA-MB-231-Zellen überein15. Die größten Amplitudenschwankungen waren vorübergehende hyperpolarisierende „Blinker“ und „Wellen“. Diese Hyperpolarisationen könnten die Amplitude des von Nav1.519,25 geleiteten „Fensterstroms“ direkt modulieren und so die intrazelluläre Na+-Konzentration und nachgeschaltete Na+-modulierte Signalwege, z. B. SIK17, verändern. Eine Hauptfunktion der VGSC-Aktivität in diesen Zellen ist die Steuerung der Proteolyse über Die perizelluläre Ansäuerung wird durch den Natrium-Wasserstoff-Austausch (NHE1) angetrieben. 51, 52. Die Tatsache, dass die hyperpolarisierende Vm-gesteuerte VGSC-Aktivität intermittierend in den Zellen auftreten würde, lässt auf Folgendes schließen: Erstens könnte dies eine bessere Kontrolle der Proteolyse gewährleisten. dh Invasion. Zweitens würde es den übermäßigen Zufluss von Na+ in Zellen und ein mögliches osmotisches Ungleichgewicht verhindern, das die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen könnte. 53. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die möglichen Mechanismen und Folgen von Vm-Schwankungen zu bewerten.

Unsere Ergebnisse stützen die Annahme, dass Vm und sein dynamisches Verhalten mit dem Verhalten von Krebszellen zusammenhängen. Erstens waren Vm-Schwankungen in Krebszelllinien viel häufiger als in „normalen“ Brustepithel-MCF-10A-Zellen. Zweitens dämpfte die Blockierung der VGSC- und KCa-Kanalaktivität die Vm-Schwankungen in MDA-MB-231-Zellen. Drittens ist umgekehrt bekannt, dass die nach der Behandlung mit TGF-β erhöhte dynamische Aktivität von Vm in MCF-10A-Zellen aggressives Verhalten in diesen Zellen induziert54. Obwohl die Rolle ruhender Vm bei der Krebsentstehung, -proliferation, -invasion und -metastasierung ausführlich charakterisiert wurde (Übersicht in Lit. 2), müssen die funktionellen Auswirkungen schneller, dynamischer Vm-Fluktuationen noch geklärt werden. In Zukunft kann die Vm-Bildgebung genutzt werden, um auf Zellebene die korrelativen und kausalen Beziehungen zwischen Vm-Verhalten und metastatischen und strukturellen Phänotypen zu bestimmen.

Wir kultivierten MDA-MB-231-Zellen, ein freundliches Geschenk des Labors von Dr. Janine Erler, in DMEM mit hohem Glucosegehalt (GIBCO, Nr. 41966029), ergänzt mit 5 % FBS (Sigma, Nr. F7524) und Penicillin-Streptomycin (Sigma, Nr. P4333). Für die Bildgebung haben wir 10.000–30.000 Zellen auf 12 mm dicken, mit Kollagen beschichteten Glasdeckgläsern (Rattenschwanzkollagen, Sigma, Nr. 122-20) ausplattiert. Die Zellen wurden am Nachmittag vor der Bildgebung ausplattiert. Die Bildgebung wurde in phenolrotfreiem Leibovitz-L-15-Medium (Thermo Fisher, Nr. 21083027) durchgeführt, außer während der Kontrollexperimente mit hohem K+-Gehalt, bei denen stattdessen physiologische Saline für Säugetiere (MPS) verwendet wurde (unten beschrieben).

MCF-10A-Zellen wurden von ATCC erhalten. Sie wurden in DMEM/F12 (GIBCO, #31331) kultiviert, ergänzt mit 5 % Pferdeserum (GIBCO, #16050), 10 μg/ml Insulin (Sigma, #I-1882), 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (Sigma, #E-9644), 100 ng/ml Choleratoxin (Sigma, #C-8052), 500 ng/ml Hydrocortison (Sigma, #H-0888) und 100 mg/ml Penicillin/Streptomycin (GIBCO, #15070). Es wurde bestätigt, dass die Zellen Mykoplasmen-negativ waren (e-Myco plus Mycoplasma PCR Detection Kit, iNtRON Biotechnology). Die Passage erfolgte mit 0,25 % Trypsin-EDTA (GIBCO), gefolgt von Zentrifugation (1000 U/min, 4 Min.) und Resuspension in einem Vollmedium. Einige Sätze von MCF-10A-Zellen wurden in transformierendem Wachstumsfaktor β1 (TGF-β; Peprotech, Nr. 100-21) bei 5 ng/ml in Vollmedium für 48–169 Stunden kultiviert, um die EMT voranzutreiben.

Die folgenden Zelllinien wurden als Teil des untersuchten Panels menschlicher Brustkrebszelllinien kultiviert. MDA-MB-468 (eine freundliche Spende des Labors von Dr. George Poulogiannis, ICR), Cal-51 (eine freundliche Spende des Labors von Prof. Nicholas Turner, ICR), SUM-159, Hs578t (freundliche Spende des Labor von Dr. Rachel Natrajan, ICR) und MDA-MB-453 (ein freundliches Geschenk des Labors von Professor Claire Isacke, ICR) wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt (GIBCO, Nr. 41966-029), ergänzt mit 10 % Hitze, kultiviert -inaktiviertes FBS (GIBCO, Nr. 10500-064) und 1 % Penicillin-Streptomycin (GIBCO, Nr. 15140-122). T-47D und BT-474, freundliche Geschenke aus dem Labor von Prof. Nicholas Turner (ICR), wurden in RPMI 1640 (GIBCO, #11835-063), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, kultiviert. Vor der Bildgebung wurden 12-mm-Glasdeckgläser mit 50 μg/ml Rattenschwanz-Typ-I-Kollagen (Corning, Nr. 354236, Charge 0295002) in 0,02 M Essigsäure beschichtet. Mit Kollagen beschichtete Deckgläser wurden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Deckgläser wurden zweimal mit PBS gewaschen und bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen. Alle Zelllinien wurden mit 0,25 % Trypsin-EDTA (GIBCO) passagiert, zentrifugiert (1000 U/min, 5 Min.) und in einem Vollmedium resuspendiert. Zur Bildgebung wurden 10.000–30.000 Zellverdünnungen auf vorbereitete Deckgläser plattiert. Für eine optimale Anlagerung durften die Zellen vor der Bildgebung über Nacht inkubieren. Es wurde bestätigt, dass alle Zelllinien Mykoplasmen-negativ waren (e-Myco Plus Mycoplasma PCR Detection Kit, iNtRON Biotechnology).

Wir haben eine 200 μM Stammlösung des elektrochromen Spannungsfarbstoffs di-4-AN(F)EP(F)PTEA29 (100-nmol-Aliquots, Potentiometrische Sonden) in L-15-Lösung hergestellt. Die Stammlösung wurde nach dem Auflösen maximal 3 Tage aufbewahrt. Unmittelbar vor der Bildgebung wuschen wir die auf dem Deckglas haftenden Zellen dreimal vorsichtig mit erwärmtem L-15, bevor wir sie unter das Mikroskop legten. Das Deckglas wurde mit einem Tantalring beschwert und in den in L-15 auf eine Endkonzentration von 3 μM verdünnten Farbstoff getaucht. Die Zellen ruhten in dieser Konfiguration 15 Minuten lang, bevor sie abgebildet wurden. Während der Bildgebung wurden die Zellen durch ein selbstgebautes Wasserperfusionssystem mit offenem Kreislauf oder durch eine beheizte Kammerplattform mit geschlossenem Kreislauf (TC-324C, PM-1, Warner Instruments) auf einer Temperatur zwischen 30 und 37 °C gehalten.

Unser speziell angefertigtes Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop erzeugte ein Bild der Zellen durch ein ×25 1,0 NA aufrechtes Wassertauchobjektiv (XLPLN25XSVMP, Olympus) und eine Tubuslinse mit 180 mm Brennweite (TTL180-A) auf einen wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiter ( sCMOS) Kamera (Orca Flash 4 v2, Hamamatsu). Die Bildgebung wurde mit zweifarbiger sequentieller Anregung durchgeführt und in einem einzigen Spektralkanal abgebildet. Die Fluoreszenz wurde in zwei Kanälen ratiometrisch angeregt, was zu Spannungssignalen in entgegengesetzter Richtung in der gesammelten Emission führte (Abb. 1c). Die LEDs wurden mit einem Cairn OptoLed (P1110/002/000) angesteuert. Der erste Kanal wurde mit einer 405-nm-LED (Cairn P1105/405/LED) beleuchtet, mit einem 405/10-nm-Bandpass (Semrock LD01-405/10) gefiltert und mit einem 495-nm-Langpass-Dichroitlicht (Semrock FF495-DI03) kombiniert. und ein zusätzlicher 496 nm langer Pass (Semrock FF01-496/LP). Der zweite Kanal wurde mit einer 530-nm-LED (Cairn P1105/530/LED) beleuchtet, mit einem 520/35-nm-Filter (Semrock FF01-520/35) gefiltert und mit einem 562-nm-Langpass-Dichroitlicht (Semrock FF562-DI03) kombiniert ). Die Emission wurde durch einen 650/150-nm-Bandpassfilter (Semrock FF01-650/150) auf der sCMOS-Kamera gesammelt (Abb. 1a). Die Bilder wurden im Micromanager 255 mit dem „Slow Scan“-Modus des Orca Flash 4 aufgenommen, wobei der globale Verschluss und das Frame-Reset mit 4 × 4-Digital-Binning verwendet wurden. Die Bildgebung wurde mit 5 Hz durchgeführt. Während jeder Bildperiode wurde in schneller Folge ein mit jeder LED beleuchtetes 3-ms-Belichtungsbild aufgenommen (Abb. S4). Die Beleuchtungsintensitäten für jeden Kanal wurden ungefähr zwischen den einzelnen Kanälen angepasst und angepasst, um eine Signalintensität von etwa 4000 Zählimpulsen/Pixel in markierten Zellmembranen zu ergeben. Die Intensitäten lagen typischerweise zwischen 0,1 und 1,3 mW/mm2 für die blaue Anregung und 1,5 und 3,4 mW/mm2 für die grüne Anregung.

Wir haben jeden Versuch aufgenommen, der aus Sequenzen von 10.000 Bildern (5.000 zweifarbig angeregten Aufnahmen) an verschiedenen Stellen auf dem Deckglas besteht. Die Aufnahmeorte wurden aus konfluenten Gebieten ausgewählt (Median 975 Zellen/mm2, Interquartilbereich 605, 1247 Zellen/mm2). Wir erfassten zwischen 1 und 6 Versuche pro Deckglas, wobei jeder Versuch an einem bestimmten Ort stattfand. In Tetrodotoxin (TTX)-Experimenten haben wir zunächst 1–2 Kontrollversuche ohne TTX („Vorversuche“) abgebildet. Anschließend fügten wir dem Bildgebungsmedium 1 mM TTX-Citrat (Abcam, ab120055) in PBS-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 1 oder 10 μM zu erreichen. 1–4 Studien wurden in Gegenwart von TTX abgebildet („Post“-Studien). Für bestimmte 10-μM-TTX-Experimente ersetzten wir nach 1–2 Versuchen, die in Gegenwart von TTX durchgeführt wurden, das TTX-haltige Medium durch normales farbstoffhaltiges L-15-Medium und bildeten 1–2 Versuche in diesem Zustand ab („Auswaschen“).

In IbTx- und Apamin-Experimenten haben wir zunächst drei Kontrollversuche ohne diese Wirkstoffe („Vorversuche“) abgebildet. Anschließend haben wir 24,1 μM entweder IbTx-Citrat (Tocris, Nr. 1086) oder Apamincitrat (Tocris, Nr. 1652) in L-15 hinzugefügt zum Bildgebungsmedium, um die Endkonzentration von 100 nM zu erreichen. In separaten Experimenten behandelten wir Zellen 45–60 Minuten lang entweder mit 100 nM Apamin oder IbTx. Die Zellen wurden dann dreimal mit L-15 gewaschen und wie beschrieben mit Spannungsfarbstoff versetzt oben, um die Vm-Dynamik nach dem Auswaschen der KCa-Inhibitoren zu beurteilen.

Einwaschversuche mit hohem Kaliumgehalt wurden in physiologischer Kochsalzlösung für Säugetiere (MPS48) durchgeführt, bestehend aus (in mM): 144 NaCl, 5,4 KCl, 5,6 d-Glucose, 5 HEPES, 1 MgCl2, 2,5 CaCl2. Während des Versuchs wurde eine Lösung mit hohem Kaliumgehalt eingewaschen, um die Zellen zur Validierung der Spannungsfarbstofffunktion zu depolarisieren. Diese Lösung war osmotisch ausgeglichen und bestand aus (in mM): 49,4 NaCl, 100 KCl, 5,6 d-Glucose, 5 HEPES, 1 MgCl2, 2,5 CaCl2.

Wir haben den Bereich der erwarteten Fluoreszenzänderung für bekannte Änderungen in Vm durch Ganzzell-Voltage-Clamp und gleichzeitige Spannungsbildgebung bewertet. Die Zellen wurden in phenolrotfreiem Liebovitz-L-15-Medium bei Raumtemperatur abgebildet. Gesunde, farbstoffmarkierte Zellen wurden ausgewählt und mit Pipetten zwischen 3 und 10 MΩ gepatcht. Die Pipette enthielt ein in intrazellulärer Lösung gebadetes Ag/AgCl (in mM): 130 K-Gluconat, 7 KCl, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 10 Phosphokreatin-Na, 10 HEPES. Spannungsklemmensignale wurden mit einem Multiclamp 700B (Molecular Devices) verstärkt und mit Power 1401 (Cambridge Electronic Design) unter Verwendung von Spike2 Version 9 digitalisiert.

Die ratiometrische Bildgebung wurde wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch mit einer erhöhten Rate von 100 Bildern/s. Während jedes Bildgebungsversuchs wurde Vm für 1-s-Epochen auf Werte zwischen –60 und +30 mV in 10-mV-Schritten geklemmt. Fluoreszenzzeitverläufe wurden für beide Anregungskanäle aus einer zellulären Region von Interesse (ROI) um die gepatchte Zelle herum extrahiert. Die Versuche wurden bleichkorrigiert und unter Verwendung einer linearen Anpassung an ihren zeitlichen Verlauf in ΔF/F0 umgerechnet. Wir haben das durchschnittliche blau-grün-erregte Rahmenverhältnis (ΔR/R0) über Versuche hinweg bei jedem Haltepotential berechnet. Eine Linie wurde an ΔR/R0 vs. Vm angepasst. Der Liniengradient spiegelt die Empfindlichkeit von ΔR/R0 gegenüber Vm (% Änderung pro 100 mV) für jede Zelle (n = 12 Zellen) wider.

Die gesamte Datenanalyse wurde in Python 3 mit NumPy56, SciPy57, Tifffile, Scikit-image58, Scikit-learn59 und Pandas60 durchgeführt. Die Abbildungen wurden mit MatPlotLib61 generiert. Unser zweifarbiges Anregungsschema erzeugte Bildzeitreihen, in denen durch blaues und grünes Licht angeregte Bilder verschachtelt wurden (Abb. 3a). Wir haben den konstanten Dunkelwert von jedem Bild subtrahiert und die Zeitreihe in zwei Farbkanäle aufgeteilt. Wir haben auf die getrennten Zeitreihen einen pixelweisen Hochpassfilter angewendet, der Signale unterdrückt, die langsamer als 0,01 Hz sind. Insbesondere wurden langsam variierende Signale (hauptsächlich Bleichen) aus jedem Kanal entfernt, indem die Stapel pixelweise durch eine zeitlich gefilterte Version ihrer selbst geteilt wurden. Der Filter war ein einheitlicher Filter mit einer Länge von 1000 Punkten. Der Filter war symmetrisch (dh der Zeitpunkt t0 wurde von den Punkten t > t0 und t < t0 gleichermaßen beeinflusst). Diese filternormalisierten Zeitreihen wurden dann blaue Bilder durch grüne Bilder geteilt, um das Verhältnisbild für jeden Zeitpunkt zu ermitteln (Abb. 3a). Die Zellen wurden mit CellPose62 segmentiert, wobei das standardmäßige zytoplasmatische Segmentierungsmodell und ein ungefährer Zelldurchmesser von 30 Pixeln verwendet wurden. Zusätzliche Segmentierungen aktiver Zellen, die das Cellpose-Netzwerk nicht identifizierte, wurden von Hand hinzugefügt. Die segmentierten ROIs wurden mit einer einzigen (1-Runde binär) erodiert, bevor die ROI-Zeitverläufe extrahiert wurden, um die Auswirkungen der Bewegung an den Zellrändern zu unterdrücken. Für jeden erodierten ROI haben wir den Median der Pixelwerte zu jedem Zeitpunkt berechnet. Der Mittelwert der Zeitverläufe wurde subtrahiert und verrechnet, so dass sie bei etwa 1 symmetrisch waren.

Wir haben einen Ereigniserkennungsalgorithmus implementiert, um signifikante Änderungen von ΔR/R0 zu identifizieren, die die Fluktuation von Vm widerspiegeln. Wir haben zunächst den zeitlichen Verlauf der pixelweisen Standardabweichung innerhalb des ROI für jeden erodierten ROI berechnet. Wir haben den Median (wie oben berechnet) und die Standardabweichung der Zeitverläufe mit einem σ = 3-Punkte- (dh 0,6 s) Gaußfilter gefiltert. Vm-Schwankungsereignisse wurden identifiziert, wenn der zeitlich gefilterte mittlere Pixelwert um mehr als das 2,5-fache der zeitlich gefilterten Standardabweichung von 1, seinem zeitlichen Durchschnittswert, abwich (Abb. 1h). Kurze Ereignisse wurden entfernt und benachbarte Ereignisse durch zwei Iterationen binärer Öffnung und dann zwei Runden binärer Schließung im erkannten Ereignisarray zusammengeführt. Wenn Ereignisse aus positiv und negativ verlaufenden ΔR/R0 bestanden, wurden sie in vollständig positiv verlaufende und vollständig negativ verlaufende Ereignisse aufgeteilt.

Zellen wurden als absterbend/tot betrachtet und von der Analyse ausgeschlossen, wenn die Helligkeit der Rohpixelwerte während der Erfassung im blauen Kanal um mehr als 25 % zunahm, was auf einen Verlust der Membranpolarisation hinweist. Ereignisse, die durch nicht spannungsbedingte Helligkeitsänderungen verursacht wurden, wurden als gleichzeitige Ereignisse identifiziert und von der Analyse ausgeschlossen. In der MCF-10A-Bildserie, in der Ereignisse sehr selten waren, wurden Bildartefakte identifiziert und ausgeschlossen, wenn mehr als drei Ereignisse zeitlich um mehr als 30 % überlappten. In den MDA-MB-231-Daten wurden Ereignisse ausgeschlossen, bei denen sich mehr als 5 Ereignisse zeitlich um mehr als 50 % überschnitten. Nach der Ereigniserkennung wurden alle aktiven Zellzeitreihen durch visuelle Inspektion der verarbeiteten Videos ausgewertet, um Ereignisse auszuschließen, die durch schwebenden Staub, Fokusverschiebungen oder andere offensichtliche Bildartefakte verursacht wurden. Ereignisse, die sowohl die automatisierten als auch die manuellen Qualitätskontrollmaßnahmen erfüllten, wurden hinsichtlich Ereignishäufigkeit, Polarität, Amplitude und Dauer analysiert.

In die merkmalsbasierte Analyse haben wir nur Versuche einbezogen, die den gesamten Bildgebungszeitraum von 920 Sekunden abgeschlossen haben (18.279 von 18.752), und dann den oben beschriebenen Ereigniserkennungsalgorithmus angewendet, um „aktive“ Zellen zu identifizieren (982 von 18.279). Wir haben dann Alle Zeitreihen mit offensichtlichen Bildartefakten (Staub usw.) wurden ausgeschlossen. Nach Qualitätskontrolle und Ereigniserkennung wurden 297 MDA-MB-231-, 28 MCF-10A- und 33 MCF-10A+TGF-β-Zeitreihen in die Studie aufgenommen Die unten beschriebene merkmalsbasierte Analysepipeline (Abb. 4a, b).

Ergänzend zur ereignisbasierten Analyse wurde die Cellular DES Pipeline entwickelt, um die ROI-extrahierten Zeitreihen anhand ihrer hervorstechendsten dynamischen Merkmale zu klassifizieren, die durch den Catch-22-Algorithmus32 extrahiert wurden. Die mit der Cellular DES Pipeline durchgeführte Analyse bietet Einblicke in die Zeitreiheneigenschaften, die über die einfache Ereigniserkennung und -quantifizierung hinausgehen, und ermöglicht die Klassifizierung der heterogenen Vm-Dynamik in ähnliche Cluster.

Aus den zugelassenen Zeitreihen haben wir mit dem Catch-22-Algorithmus 22 Merkmale aus der mittleren Zeitreihe jedes zellulären ROI extrahiert (Abb. 4c). Nach der Darstellung der Verteilung der einzelnen Merkmale hatten etwa 80 % (259/324) der Zellen den gleichen Wert für das Merkmal, das dem ersten Minimum der automatischen Informationsfunktion entspricht, das wir anschließend aus der Merkmalsliste ausgeschlossen haben. Wir haben die Rohmerkmalswerte für die verbleibenden 21 Merkmale zwischen 0,0001 und 1 neu skaliert und die Box-Cox-Transformation angewendet, um ihre Verteilungen zu normalisieren. Anschließend haben wir die normalisierten Werte auf einen Wert zwischen 0 und 1 neu skaliert, um eine gleichmäßige Gewichtung in den Clustering-Algorithmen sicherzustellen. Um die Anzahl der dynamischen elektrischen Signaturklassen (DES) zu bewerten, haben wir hierarchisches Clustering und Gaußsche Mischungsmodellierung (GMM) für die 21 normalisierten Merkmale implementiert. Beide Clustering-Algorithmen generierten Cluster mit Silhouette-Koeffizienten, die die Subtyp-Unähnlichkeit63 messen und zwischen 5 und 6 Clustern auf ihre niedrigsten Werte abnahmen (Abb. 4d). Basierend auf diesen Silhouette-Scores und einer visuellen Inspektion der Zeitreihen haben wir uns entschieden, die Zeitreihen in vier Typen zu sortieren, da dies zu den homogensten Klassen führte. Basierend auf dem allgemeinen Muster jedes Typs haben wir die DES-Klassen benannt: kleines Blinken (blinken-s), winkendes Blinken, lautes Blinken und großes Blinken (blinken-l).

Um eine beispielhafte Zeitreihe aus jeder DES-Klasse auszuwählen (Abb. 5), führten wir eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durch und visualisierten die vier Klassen in einem zweidimensionalen Merkmalsraum. Jeder Feature-Cluster nimmt einen einzigartigen Bereich des PC-Raums ein. Um die beispielhaften Zeitreihen jedes Typs zu identifizieren, haben wir die Komponenten jedes Merkmals berechnet und einen Vektor für die Koeffizienten PC1 und PC2 jedes Merkmals gezeichnet (Abb. 5). Diese Vektoren weisen daher auf den Typ hin, der die entsprechenden Merkmale am deutlichsten aufweist. Um beispielhafte Zeitreihen für jeden Typ zu identifizieren, haben wir die Zeitreihen nach dem Merkmal sortiert, dessen Vektor auf diesen Typ zeigt.

Die mittleren negativen Ereignisraten (−VE) wurden durch einen Bootstrapping-Signifikanztest, einseitig oder zweiseitig, mit der Anzahl der Zellen, der Anzahl der Kulturen („Slips“) und den jeweils angegebenen resultierenden p-Werten verglichen. Die Zusatzdaten enthalten die Daten, die zur Generierung aller Zahlen verwendet wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und analysierten bildgebenden und elektrophysiologischen Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Der Analysecode ist unter https://github.com/peq10/cancer_vsd64 verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. Julia Gallinaro für ihre Ratschläge zur Quantifizierung der Synchronität innerhalb der Zeitverläufe. Diese Arbeit wurde durch einen Pump-Prime-Preis des Integrated Biological Imaging Network (IBIN3AF), der Royal Academy of Engineering im Rahmen des RAEng Research Fellowships-Programms (RF1415/14/26) und des Biotechnology and Biology Research Council (BB/R009007/) unterstützt. 1), einem Wellcome Trust Seed Award (Grant No. 201964/Z/16/Z), dem Engineering and Physical Sciences Research Council (Grant No. EP/L016737/1 an das Imperial College) und von einem Cancer Research UK and Stand Bis zum Preis der Cancer UK Program Foundation an CB (C37275/1A20146).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Peter Quicke, Yilin Sun.

Abteilung für Bioingenieurwesen, Imperial College London, London, SW7 2AL, Großbritannien

Peter Quicke, Yilin Sun und Amanda J. Foust

Das Francis Crick Institute, London, NW1 1AT, Großbritannien

Peter Quicke

Institut für Krebsforschung, Krebsbiologie, London, SW3 6JB, Großbritannien

Mar Arias-Garcia, Melina Beykou und Chris Bakal

Fakultät für Elektrotechnik und Elektronik, Imperial College London, London, SW7 2AZ, Großbritannien

Melina Beykou

University of Connecticut School of Medicine, RD Berlin Center for Cell Analysis and Modeling, Farmington, CT, USA

Corey D. Acker

Department of Life Sciences, Imperial College London, London, SW7 2AZ, Großbritannien

Mustafa BA Djamgoz

Biotechnologisches Forschungszentrum, Cyprus International University, Haspolat, Nikosia, TRNC, Mersin 10, Türkei

Mustafa BA Djamgoz

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PQ entwickelte das Bilderfassungssystem und die Methoden unter Anleitung von CDA und AJF, PQ, YS, MBAD, CB und AJF entwarfen die Experimente. PQ und YS führten die Experimente durch und analysierten die Bilder. PQ entwarf und PQ und YS führten die ereignisbasierte Analyse durch. MAG und MB kultivierten und plattierten die Zellen MCF-10A, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-474, CAL-51, Hs-578T, SUM159 und T-47D. YS entwickelte die Cellular DES Pipeline unter Anleitung von CB, MBAD, AJF und PQYS führte die merkmalsbasierte Analyse mit Unterstützung von PQPQ durch, YS, MAG, MB, CB, MBAD und AJF schrieben das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Chris Bakal oder Amanda J. Foust.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: CDA ist Eigentümer und Mitarbeiter von Potentimetric Probes LLC, das spannungsempfindliche Farbstoffe entwickelt und vertreibt. MBAD ist an einem kleinen Biotech-Unternehmen beteiligt, das Ionenkanalmodulatoren als Krebsmedikamente entwickelt. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt Han-Gang Yu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Chao Zhou und Karli Montague-Cardoso. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Quicke, P., Sun, Y., Arias-Garcia, M. et al. Spannungsbildgebung enthüllt die dynamischen elektrischen Signaturen menschlicher Brustkrebszellen. Commun Biol 5, 1178 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04077-2

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Eingegangen: 11. November 2021

Angenommen: 05. Oktober 2022

Veröffentlicht: 11. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04077-2

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