Kontrollierte Tumorheterogenität in einer Co

Dec 27, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13648 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Resistenz gegen Krebsbehandlungen wird durch das Vorhandensein verschiedener Zelltypen und die Heterogenität innerhalb des Tumors verursacht. Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Zellen sowie Zell-Mikroumgebungen spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression und -invasion, die wichtige Auswirkungen auf die Diagnose und die Resistenz gegen Chemotherapie haben. In dieser Studie entwickeln wir 3D-Biodruck-In-vitro-Modelle der Mikroumgebung des Brustkrebstumors aus kokultivierten Zellen, die in einer Hydrogelmatrix mit kontrollierter Architektur verteilt sind, um die Tumorheterogenität zu modellieren. Wir gehen davon aus, dass der Tumor durch ein mit Krebszellen beladenes Co-Kultur-Hydrogel-Konstrukt dargestellt werden könnte, während seine Mikroumgebung in einem Mikrofluidik-Chip modelliert werden kann, der einen chemischen Gradienten erzeugen kann. Brustkrebszellen (MCF7 und MDA-MB-231) und nicht tumorerzeugende Brustepithelzellen (MCF10A) wurden in die Alginat-Gelatine-Hydrogele eingebettet und mit einem Extrusions-Biodrucker mit mehreren Kartuschen gedruckt. Unser Ansatz ermöglicht eine präzise Kontrolle über Position und Anordnung von Zellen in einem Co-Kultursystem und ermöglicht so die Gestaltung verschiedener Tumorarchitekturen. Wir erstellten Proben mit zwei verschiedenen Zelltypen an bestimmten Ausgangsorten, wobei die Dichte jedes Zelltyps sorgfältig kontrolliert wurde. Die Zellen wurden entweder zufällig gemischt oder in aufeinanderfolgenden Schichten angeordnet, um zelluläre Heterogenität zu erzeugen. Um die Zellmigration in Richtung Chemoattractant zu untersuchen, haben wir eine chemische Mikroumgebung in einer Kammer mit einem allmählichen chemischen Gradienten entwickelt. Als Proof of Concept untersuchten wir mit diesem Gerät verschiedene Migrationsmuster von MDA-MB-231-Zellen in Richtung des epithelialen Wachstumsfaktorgradienten in Gegenwart von MCF10A-Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen. Unser Ansatz beinhaltet die Integration von 3D-Bioprinting und mikrofluidischen Geräten, um verschiedene Tumorarchitekturen zu schaffen, die repräsentativ für die bei verschiedenen Patienten vorkommenden sind. Dies stellt ein hervorragendes Werkzeug zur Untersuchung des Verhaltens von Krebszellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar.

Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen und die zweithäufigste Krebserkrankung insgesamt1. Im Jahr 2018 gab es über zwei Millionen neue Fälle, und mehr als 30 % dieser Frauen starben1. Die Aggressivität von Brustkrebs kann auf die bekannte Heterogenität von Brusttumoren zurückzuführen sein2. Tumorheterogenität wurde bei Patientinnen (Inter-Tumor-Heterogenität) und bei jedem einzelnen Tumor (Intratumor-Heterogenität) beobachtet, was zu Brustkrebsaggressivität und Herausforderungen bei der Behandlung führt3. Da Tumoren aus phänotypisch unterschiedlichen Krebszellpopulationen mit unterschiedlichen Eigenschaften bestehen können, geben durch Biopsie entnommene Tumorproben nicht die genaue Zusammensetzung des Tumors wieder. Bei intratumoraler Heterogenität besteht der Tumor aus unterschiedlichen phänotypischen Zellpopulationen, die durch unterschiedliche Zellphänotypen, Zelldichten oder deren Lokalisierung im Tumor identifiziert werden können4,5.

Herkömmlichen Modellen fehlt die räumliche zelluläre Heterogenität von Brustkrebs und sie sind in der Regel auf äußere Reize oder Belastungen angewiesen, was sie bei der Bildung und Untersuchung physiologischer Tumoren zu einer Herausforderung macht6. Auch zweidimensionale (2D) Kulturmodelle können die Heterogenität und Mikroumgebung des Tumors nicht nachahmen7, während das Tumorwachstum in vivo in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung stattfindet, in der die Krebszellen in ständigem und engem Kontakt mit der extrazellulären Matrix (ECM) stehen. und andere Zellen. Die Entwicklung von 3D-Krebsmodellen bietet wirtschaftliche und ethische Vorteile für die Vorhersage der Tumorreaktion auf die Behandlung, indem sie wichtige Aspekte von Tumoren reproduziert, wie z. B. das Vorhandensein von Sauerstoff- und Nährstoffgradienten, Zell-Zell-Interaktionen, Arzneimittelpenetration und Subpopulationen ruhender Zellen8. Darüber hinaus schließen 3D-In-vitro-Modelle die Lücke zwischen 2D- und In-vivo-Studien und reduzieren so die Zahl der in präklinischen Studien getöteten Tiere9. Durch das Hinzufügen eines Mikrofluidiksystems zu einer 3D-Kultur in einem sogenannten Tumor-on-Chip-System wird die Rekapitulation des TME noch genauer und liefert wertvolle Einblicke in die Krebsbiologie10,11.

Mikrofluidische Plattformen werden für In-vitro-Studien verwendet, um physikalische und chemische Reize bei der Zellmigration, einschließlich der Steifheit der Umgebung, nachzuahmen12. Sie untersuchten auch die Ausbreitung von Krebs durch Übertragung über eine endotheliale Monoschicht13, eine perfundierbare, knochenähnliche Mikroumgebung14 oder über ein mikrovaskuläres Netzwerk15,16. Diese Geräte weisen jedoch einige Einschränkungen auf, die auf eine übermäßige Miniaturisierung, eine geringe Zellenzahl und die meist 2D-Modellierung zurückzuführen sind. Neben Tumor-on-Chip-Modellen werden auch andere In-vitro-Modelle entwickelt, um Zellmigration und Metastasierungsmechanismen einschließlich antimetastatischer Wirkstoffe zu untersuchen. Da wir die Rolle des Crosstalks zwischen Krebszellen und Wirtszellen in der Metastasenkaskade kennen, wurden mehrschichtige Modelle entwickelt, die eine relativ ähnliche Mikroumgebung in vivo nachahmen können17,18. Transwell-Systeme werden auch verwendet (mit und ohne Hydrogel), bei denen ein bestimmter Zelltyp über einer porösen Membran und ein anderer auf dem Boden einer Kulturplatte ausgesät wird19,20.

Bioprinting hat in jüngster Zeit große Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da es die Möglichkeit bietet, Gewebekonstrukte durch präzise Positionierung von Zellen und Biomaterialien in einem schichtweisen Verfahren aufzubauen21,22. Bei dieser Methode werden lebende Zellen und ECM-Komponenten zusammengedruckt, wodurch ein „Bioink“ entsteht, der die zusammengesetzte und geometrische Komplexität der Tumormikroumgebung (TME) nachbilden und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen bewahren kann23,24,25. Zu den aktuellen Bioprinting-Methoden gehören Tintenstrahl, Extrusion und lasergestütztes Drucken26,27. Unter anderem bietet die Extrusionsmethode eine vielseitige Materialauswahl und ermöglicht die Kontrolle der Tumorheterogenität innerhalb der gedruckten Matrizen durch eine strenge räumliche Kontrolle unterschiedlicher Materialtypen an unterschiedlichen Ausgangsorten27. Dieser hoch reproduzierbare Prozess ermöglicht auch die Abscheidung von Materialien, in die Zellen einer bekannten Dichte eingebettet sind. Der Hauptvorteil der Extrusions-Bioprinting-Technologie ist die Fähigkeit, sehr hohe Zelldichten nahe der physiologischen Zelldichte abzuscheiden, was ein Hauptziel von Bioprinting-Methoden ist26,27. Extrusions-Biodruck wurde erfolgreich zum Aufbau von Gewebekonstrukten im menschlichen Maßstab28, Gefäßstrukturen29,30 und Hautgeweben31,32 eingesetzt und führt zu einer hohen Drucktreue und Lebensfähigkeit der Zellen.

Unser Ziel ist es, eine Plattform zur Modellierung der phänotypischen Heterogenität zu etablieren, die aufgrund unterschiedlicher Zelllokalisation in einem Tumor (Tumorzentrum oder -peripherie, ungleichmäßige Sauerstoffmenge) und/oder Interaktion mit TME auftreten kann. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Design und der Konstruktion von In-vitro-Tumormodellen mittels physikalischer und chemischer Mittel durch den 3D-Bioprinting von kokultivierten Zellen mit kontrollierter Verteilung in einer Hydrogelmatrix in einem mikrofluidischen Gerät. Unsere Hypothese ist, dass der Tumor durch ein mit Krebszellen beladenes Co-Kultur-Hydrogel-Konstrukt dargestellt werden könnte, während seine Mikroumgebung in einem Mikrofluidik-Chip modelliert werden kann, der einen chemischen Gradienten erzeugen kann. Unser zusammengesetztes Hydrogel als Biotinte besteht aus Alginat und Gelatine und ist mit der mikroskopischen Architektur eines nativen Tumorstromas kompatibel. Die zellbeladenen Strukturen, bei denen es sich um Brustkrebszellen handelt, die in die Hydrogele eingebettet und über einen extrusionsbasierten Biodrucker gedruckt werden, werden einen 3D-Modelltumor erzeugen, der die Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir haben unseren Bioink auf der Grundlage von Messungen der Druckbarkeit und Zelllebensfähigkeit optimiert. Co-kultivierte 3D-Bioprint-Konstrukte werden mit der am besten ausgewählten Biotinte entwickelt. Wir verwenden einen Extrusions-Biodrucker mit mehreren Kartuschen, der es uns ermöglicht, zellulär heterogene Proben zu entwickeln, die aus zwei verschiedenen Brustkrebszellen an bestimmten Anfangsstellen und einer bestimmten Architektur mit kontrollierter Dichte bestehen.

Die Entwicklung einer migrationsinduzierenden chemischen Mikroumgebung dient der Schaffung einer In-vitro-Plattform zur Behandlung von Metastasenverhalten, was von aktuellen In-vitro-Tumormodellen noch nicht vollständig erreicht werden kann. Extrazelluläre chemische Gradienten werden über 3D-gedruckte Konstrukte, die Wachstumsfaktoren in der Kammer enthalten, dynamisch manipuliert, was eine zelluläre Modulation nach dem Druck ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht sowohl die räumliche (über den 3D-Druck) als auch die zeitliche (über die Gradientenkonzentration und Flussrate) Erzeugung chemischer Hinweise in 3D-Matrizen sowie die dynamische Regulierung des zellulären Verhaltens auf lokaler Ebene. Der epitheliale Wachstumsfaktor (EGF) wird als Proof of Concept verwendet, um die Migration von Zellen im 3D-Konstrukt in Richtung des Chemoattraktors zu modellieren. MDA-MB-231-Zellen zeigen ein anderes Migrationsmuster in Richtung des epithelialen Wachstumsfaktorgradienten im Gerät, wenn die Tumorarchitektur unterschiedlich ist. Es gibt nur wenige neuere Arbeiten, die Organ-on-a-Chip-Plattformen nutzen, um Heterogenität oder Metastasierung bei Brustkrebs zu untersuchen33,34. Nach unserem besten Wissen liegen jedoch keine Studien zum 3D-Bioprinting von Co-Kulturen in einer mikrofluidischen Umgebung mit kontrollierter Architektur vor. Darüber hinaus handelt es sich bei den meisten aktuellen In-vitro-Modellen entweder um 2D-Modelle oder sie bestehen nur aus einem Zelltyp. Um physiologisch relevant zu sein, sollte das Modell auch die komplexen zellulären Wechselwirkungen innerhalb des TME berücksichtigen. Die Kombination dieser 3D-Bioprinting-Ansätze für die In-vitro-Tumormodellierung mit mikrofluidischen Geräten zur Modellierung der Mikroumgebung bietet Werkzeuge zur Erstellung komplexer Tumorarchitekturen mit kontrollierter chemischer Dichte und einer hohen räumlich-zeitlichen Auflösung, die über das hinausgeht, was mit herkömmlichen Herstellungstechnologien möglich ist.

Gelatine aus Rinderhaut (Typ B) und Alginsäure-Natriumsalz, Dimethylsulfoxid (DMSO), Calciumchlorid und Natriumchloridpulver wurden von Sigma-Aldrich (Kanada) bezogen. Calciumchlorid wurde in Millipore-Wasser in einer Endkonzentration von 4 % gelöst, mit 0,2-u-Filtern filtriert und zur weiteren Verwendung steril gelagert. Für Zellkulturstudien wurden MCF7- und MDA-MB-231-Zelllinien von ATCC (Cedarlane, Kanada) erworben. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ohne Natriumpyruvat, mit 4,5 g/l Glucose, mit L-Glutamin), PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 1x, Penicillin-Streptomycin, Trypsin/EDTA-Lösung bei 0,25 % (w./v. ) und FBS (fötales Rinderserum) wurden von Wisent Bioproducts (Kanada) bezogen. (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazol)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) MTT-Pulver, Triton X-100, BSA (Rinderserumalbumin), Paraformaldehyd, ein Test auf die Lebensfähigkeit lebender/toter Zellen Kit (CBA415) und Hoechst 33342 Nuclei Dye, Propidium Iodide (PI) und Calcine wurden von Sigma-Aldrich (Kanada) gekauft. Für das Bioprinting wurden die Mischspritze (5 ml) mit dem Mischverhältnis 4:1 und kompatible Mischspitzen von Sulzer Inc. (Schweiz) gekauft. Leere Kartuschen und Düsen gekauft bei Cellink (Schweden)

Natriumalginat und Gelatine (Typ A, 90–110 Bloom, gewonnen aus Schweinehaut) wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Bioink-Formulierungen wurden mit verschiedenen Verhältnissen von Alginat und Gelatine hergestellt. Gemäß dem Protokoll von Ouyang et al.35 wurden Gelatine- und Alginatpulvermischungen mit unterschiedlichen Verhältnissen zunächst in 0,5 %iger Natriumchloridsalzlösung gelöst. Anschließend wurde die Lösung eine halbe Stunde lang auf einer Heizplatte bei 85 °C kräftig gerührt. Die Hydrogele wurden unter eine Biosicherheitswerkbank gebracht und 20 Minuten lang mit UV-Licht behandelt. Anschließend wurden alle Bioink-Formationen vor den rheologischen Tests 2–4 Stunden lang bei Raumtemperatur (23–24 °C) und zur längeren Lagerung im Kühlschrank (4 °C) aufbewahrt. Alle nachfolgenden Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

Für unsere Experimente verwendeten wir zwei Arten von Zellen: MCF7- und MDA-MB-231-Brustkrebszelllinien, gekauft von ATCC. Die Zellen wurden ein- oder zweimal pro Woche passagiert und in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin kultiviert, was im Folgenden als vollständiges DMEM bezeichnet wird, wie vom Lieferanten empfohlen. Die Experimente wurden mit Zellen durchgeführt, die weniger als zehnmal passagiert wurden. Das Mischen von Zellen und Hydrogel erfolgte unter einer Biosicherheitswerkbank mit den Doppelmischspritzen im Verhältnis 4:1 (Gel:Zelle). Kartuschen mit Biotinten, die Zellen enthielten, wurden sofort zum Bioprinting unter sterilen Bedingungen verwendet.

CELLINK INCREDIBLE+ (CELLINK AB) wurde für den Druck von Einzelzell- und Mehrfachzell-beladenen Konstrukten verwendet. Die Biotinte wurde in sterile Druckkartuschen geladen und die Biotinte wurde mithilfe extrusionsbasierter Druckköpfe durch Düsen extrudiert. Für den sequentiellen Druck zweier verschiedener Zellen wurden zwei separate Patronen verwendet. Der Materialfluss für jeden Druckkopf wurde durch individuelle Druck- und Geschwindigkeitsregler gesteuert. Die Bewegungsgeschwindigkeit der Nadel wurde auf 5 mms−1 eingestellt. Vordefinierte Strukturen wurden mit der Solidworks-Software implementiert und in der Sli3r-Software mit einem geradlinigen Füllmuster in 10 Schichten geschnitten (Abb. 1A). Die Bedruckbarkeit von Alginat-Gelatine-Hydrogelen unter Verwendung einer Kombination verschiedener Hydrogelzusammensetzungen und Druckdrücke wurde unter Verwendung einer sterilen, hochpräzisen konischen 22G-Düse (0,41 mm Innendurchmesser) bewertet (Ergänzungstabelle 1, Hintergrundinformationen). Alle Komponenten der Bioink-Zubereitung wurden vor dem Drucken unter Verwendung von UV-Licht in BSC und 1-stündigem Einweichen in 70 %igem Ethanol sterilisiert. Alginat- und Gelatinepulver 20 Minuten lang unter BSC-UV sterilisiert. Dem Pulver wird sterilisiertes Wasser zugesetzt und der Behälter abgedeckt. Anschließend wird der Behälter unter magnetischem Rühren 1 Stunde lang bei 85 °C auf eine Heizplatte gestellt. Die vorbereitete Tinte wird bis zum Abkühlen unter BSC-UV-Licht gestellt, bevor sie mit den Zellen vermischt wird. Der Drucker, das Druckbett und der Druckkopf wurden bei Raumtemperatur gehalten. Die biogedruckten Konstrukte wurden anschließend 10 Minuten lang in 4 % (w/v) steriles CaCl2 getaucht, um Natriumalginat mit Calciumionen zu vernetzen. Nach 10 Minuten wurden die zellbeladenen Konstrukte dreimal mit PBS gewaschen, in ein Wachstumsmedium (DMEM) getaucht, das 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt, und zur weiteren Analyse inkubiert (37 °C, 5 % CO2). Das Kulturmedium wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht.

(A) Die schematische Darstellung des Biofabrikationsprozesses, (B) der Drucker und die biogedruckten Konstrukte (zur Veranschaulichung wurde Lebensmittelfarbe verwendet).

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels MTT und Lebend- und Tot-Assays an biogedruckten Strukturen unmittelbar nach dem Drucken und nach 4, 7 und 11 Tagen bewertet. Die Zelllebensfähigkeitseigenschaften von Konstrukten wurden unter Verwendung eines Live/Dead-Färbungslebensfähigkeitskits basierend auf den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, jedes Konstrukt wurde in 1 µM Calcine-AM-Farbstofflösung getaucht und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird die Lösung abgesaugt und die Konstrukte in 2 µM Propidiumiodidlösung getaucht und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt. Die Färbelösung wurde entfernt und die Konstrukte wurden zweimal für 15 Minuten in PBS eingeweicht. Ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss LSM 700) wurde verwendet, um lebende und tote Zellen in den Konstrukten in fünf technischen Replikaten abzubilden. Drei Konstrukte (drei biologische Replikate) (n = 3) wurden zur quantitativen Analyse der Lebensfähigkeit der Zellen verwendet. Basierend auf den lebenden und toten Bildern wurde die quantitative Lebensfähigkeit der Zellen manuell mit der ImageJ-Software (NIH) gezählt und auf der Grundlage der Anzahl lebender Zellen (grün gefärbte Zellen) über der Gesamtzahl der Zellen (lebend + tot) berechnet.

Die Zellproliferation innerhalb des 3D-Netzwerks aus drei biologischen Replikaten wurde mithilfe des MTT-Assays untersucht. 900 μl DMEM und 100 μl MTT-Arbeitslösung (0,5 mg mL−1 in PBS) wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen auf jedem Konstrukt gegeben und 3 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Zum geplanten Zeitpunkt wurde das Medium verworfen und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Zellmembranen und unlösliche Formazankristalle wurden aufgelöst, indem 30 Minuten lang 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auf jede Struktur aufgetragen und vor Licht geschützt wurde. Die erhaltene Lösung wurde in ein 96-Well-Multiwell überführt und die optische Dichte wurde bei 540 nm mit einem Absorbance Microplate Reader (Biotek Synergy H1, Agilent) bewertet. Die Ergebnisse der Zelllebensfähigkeit wurden als UV-Vis-Absorption jeder Probe im Vergleich zur Negativkontroll-Absorption ausgedrückt, bei der es sich um einen 3D-Konstrukt-Prototyp ohne Zellen handelt, um Polymerinterferenzen bei der UV-Vis-Messung auszuschließen.

Die PKH67- und PKH26-Fluoreszenz-Zelllinker-Kits wurden mithilfe einer proprietären Membranmarkierungstechnologie verwendet, um einen grünen und roten Fluoreszenzfarbstoff mit langen aliphatischen Schwänzen stabil in Lipidregionen der Zellmembran einzubauen36. Verdünnungsmittel C wird als Markierungsvehikel verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die Farbstofflöslichkeit und Färbeeffizienz während des Markierungsschritts zu maximieren. Die Zellen wurden zentrifugiert und in einem Medium ohne Serum (nur DMEM) suspendiert. 4 μl PKH67 (grün) oder PKH26 (rot) wurden zu 1 ml Verdünnungsmittel C gegeben und gut gemischt, um es zu dispergieren. Die Zellpellets wurden in 1 ml Verdünnungsmittel C dispergiert. Die Zellsuspensionslösung und die Farbstofflösung wurden schnell gemischt und durch vorsichtiges Pipettieren homogenisiert und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Färbung wurde durch Zugabe von 10 ml Vollmedium (DMEM + 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin) gestoppt. Die Zellen wurden nur noch zweimal zentrifugiert und mit DMEM gewaschen, um die Entfernung von ungebundenem Farbstoff sicherzustellen.

Alle Konstrukte wurden mittels Nikon Eclipse Ti2 und geeigneten Filtern auf Hellfeldbildgebung und Fluoreszenzbildmikroskopie untersucht. Ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss LSM 700) wurde verwendet, um die Zellmorphologie und Zellverteilung innerhalb der 3D-gedruckten Konstrukte zu beobachten. An jeder Beobachtungsposition wurde ein Z-Stapel-Scan (400 μm Dicke) mit 5- oder 10-μm-Schritten bei 4-facher Vergrößerung durchgeführt.

Rheologische Messungen von Bioink-Formulierungen wurden mit einem Malvern Kinexus Ultra+ Rheometer mit einer 20 mm parallelen Plattengeometrie und einem 1 mm Spalt durchgeführt. Um die Hydrogelprobe zu laden, wurde das Hydrogel auf die untere Platte des Rheometers gelegt und die Stahlplattengeometrie abgesenkt, bis Kontakt mit der Oberfläche der Bioink-Probe hergestellt wurde. Anschließend wurde die überschüssige Probe rund um die Platte mit einem Spatel entfernt. Die elastischen und viskosen Module von Hydrogelen wurden bei 25 °C und 15 °C bei einer Dehnung von 0,1 % bewertet. Die Viskositäten aller Proben wurden bei 25 °C und einer Schergeschwindigkeit von 1–100 s−1 gemessen. Der Scherelastizitätsmodul G‘, der Scherverlustmodul G‘‘ und der Verlustfaktor tan(δ) wurden für jeden Hydrogel-Bioink mithilfe eines Scherdehnungs-Sweep-Tests im Bereich von 0,02 bis 1,0 % bei einer Schwingungsfrequenz von 40 Hz gemessen. Alle rheologischen Messungen wurden dreifach durchgeführt.

Design Es wird ein baumartiger Gradientengenerator entworfen, der in das 3D-Bioprinting für das Tumor-on-Chip-Modell integriert werden kann. Das Gerät verfügt über zwei Einlässe für die Injektion des Kulturmediums sowie des gewünschten Reagenzes. Über eine Kammer hinweg wird ein linearer Gradient des Reagenzes erzeugt, während die Abfallstoffe das Gerät durch sechs Auslässe neben dieser Kammer verlassen. Ein Algorithmus wurde verwendet, um die Länge der Zweige in jedem Schritt der Mischkanäle zu ermitteln, wobei davon ausgegangen wurde, dass die Breite der Kanäle und ihre Höhe 400 μm bzw. 50 μm betrugen. Das gesamte Modell ist 21 mm breit und 45 mm lang.

Herstellung Zur Herstellung eines mikrofluidischen Gradientengenerators wurde ein Standard-Lithographieverfahren befolgt. Kurz gesagt wurde eine 50 μm dicke Schicht aus SU8-2050-Negativfotolack auf einen gereinigten Si-Wafer aufgeschleudert und anschließend durch Spülen mit SU8-Ätzmittel strukturiert und entwickelt, um die Form für die Mikrokanäle zu bilden. Als nächstes wurde ein PDMS-Verhältnis von 10:1 auf die Form gestrichen und 12 Stunden lang bei 65 °C belassen, um vollständig zu polymerisieren. Der Gusssplitter im PDMS wurde abgezogen und an der Stelle der Ein-/Auslässe wurden Löcher gestanzt. Der Kammerbereich wurde ebenfalls mit einer Klinge ausgeschnitten, um Platz für den Tumoraufdruck zu schaffen. Anschließend wurde die PDMS-Schicht mithilfe von Sauerstoffplasma in einem Plasmareiniger an einen Glasobjektträger gebunden. Der so vorbereitete Mikrofluidikchip wurde zur Desinfektion UV-Licht ausgesetzt, bevor Tumore direkt in der Kammer bioprintiert oder in die Kammer überführt wurden. Ein weiterer Glasobjektträger wurde mit Sauerstoffplasma aktiviert und versiegelte die Oberseite der Kammer. Durch die Einlässe wurde sofort ein Fluss von Zellkulturmedium mit einer Spritzenpumpe eingeleitet, um die Lebensfähigkeit der Zellen sicherzustellen. Die Quelle in einem der Einlässe wurde dann mit dem gewünschten Reagenz ausgetauscht, um den Gradienten in der Kammer zu erzeugen. Das Gerät wurde während des gesamten Experiments in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 aufbewahrt und regelmäßig überprüft.

In dieser Studie wurden drei Zellkulturmodelle erstellt, darunter ein 2D-Modell, ein sequentielles 3D-Bioprinting-Modell und ein kokultiviertes 3D-Bioprinting-Modell, allesamt auf dem Mikrofluidikgerät. Das 2D-Modell wurde einfach durch Kultivieren von MCF7- und MDA-MB-231-Zellen in Platten mit 12 Vertiefungen bis zu einer Konfluenz von 80 % erstellt, sofern nicht anders angegeben. Für Co-Kultur-Experimente wurden die Zellen mit verschiedenen fluoreszierenden Markern markiert, bevor sie während des Experiments im Fluoreszenzmikroskop so kultiviert wurden, dass sie deutlich sichtbar waren. Für das sequentielle Bioprinting wurde ein G-Code für den Bioprinter vorbereitet, um den Wechsel zwischen zwei Druckköpfen in alternativen Schichten zu ermöglichen, wobei jede Schicht mit einer der Biotinten, einschließlich Zellen vom Typ A oder Typ B, gedruckt wurde. Für die biogedruckten Konstrukte mit gemischten Zellen wurden zwei verschiedene Zelltypen entweder mit grünen oder roten Markierungen markiert, um sie unterscheidbar zu machen. Das Hydrogel wurde mit Zellen im gewünschten Verhältnis von zwei Zellen und im gewünschten Verhältnis von Gel zu Zellen gemischt. Eine Kartusche mit gemischten Zellen wurde Schicht für Schicht vorbereitet und gedruckt. Für die Mikrofluidik-Chip-Experimente werden die Konstrukte je nach Testdesign entweder direkt in der Mikrofluidikkammer gedruckt oder später in die Kammer übertragen.

In der Vorstudie wurden verschiedene Hydrogele mit 1–10 % Alginat und 4–10 % Gelatine hergestellt und bei Raumtemperatur mit dem INKREDIBLE-Biodrucker (Cellink, Schweden) gedruckt. Der kleine Düsendurchmesser führt zu einer höheren Auflösung, erhöht jedoch die Zellschädigung aufgrund des hohen Extrusionsdrucks. Andererseits wurde in früheren Studien berichtet, dass beim Niederdruckdrucken mit einem größeren Düsendurchmesser eine geringe Formtreue erzielt wird26. Es bietet jedoch eine bessere Voraussetzung für die Lebensfähigkeit der Zellen. Es wurde ein quantitativer Zusammenhang zwischen Düsengröße und Abgabedruck auf die Lebensfähigkeit der Zellen gefunden37. Hier wurde jedes Hydrogel mit zwei Düsendurchmessern gedruckt, 25 G (Rot, 250 µm Innendurchmesser) und 22G (Blau, 410 µm Innendurchmesser). Abbildung 1A zeigt die schematische Darstellung des Biofabrikationsprozesses und gedruckter Strukturen und Abbildung 1B zeigt die gedruckten Konstrukte. Wir setzten den Biodruck mit einer 22G-Düse fort, die weniger Extrusionsdruck benötigt und sich nach dem Drucken als günstig für die Lebensfähigkeit der Zellen erwies. Nach der Herstellung von Bioink durch Mischen von Hydrogel und Zellen wurde das Bioprinting-Verfahren nacheinander mit zwei Druckköpfen angewendet, die entweder Zellen vom Typ A und Zellen vom Typ B getrennt enthielten. Anschließend wurde das gedruckte Konstrukt zur Vernetzung 10 Minuten lang in CaCl2 getaucht. Nach dem Waschen mit PBS wurde jedes Konstrukt in Zellmedium (DMEM, mit 10 % PBS, 1 % Pen-Stripe) eingetaucht und bei 37 °C inkubiert. Ergänzende Tabelle 1 (Hintergrundinformationen) fasst den angewandten Druck, den Filamentzustand und die Qualität der gedruckten Struktur basierend auf Düsengröße und Hydrogelzusammensetzung zusammen.

Um die Verteilung der Zellen im gedruckten Konstrukt zu visualisieren, wurden die Zellmembranen vor dem Drucken mit einem grün fluoreszierenden Membranmarker (PKH67) vorgefärbt und unmittelbar nach dem Drucken mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Abbildung 2A zeigt, dass die Zellen im Konstrukt homogen verteilt waren. Die Lebensfähigkeit verschiedener Zellen nach dem Drucken wurde mithilfe eines Lebend-Tot-Färbetests bestimmt. Die lebenden/toten Färbereagenzien wurden jeder Struktur unmittelbar nach dem Bioprinting zugesetzt, wie im experimentellen Abschnitt beschrieben. Der Status des Zellüberlebens wurde als prozentuales Verhältnis der lebenden Zellen zur Gesamtzahl der Zellen definiert, wobei die grüne Fluoreszenz von Calcium-Acetoxymethyl lebende Zellen und die rote Fluoreszenz von Propidiumiodid tote Zellen anfärbte. Die Lebensfähigkeit der Zellen ist ein wesentlicher Faktor für die erfolgreiche Herstellung zellgedruckter Konstrukte. Die Ergebnisse des Lebend-Tot-Assays (Abb. 2B) zeigen, dass der Prozentsatz lebensfähiger MDA-MB-231-Zellen unmittelbar nach dem Drucken 94,16 %, 96,94 %, 75,96 % und 84,7 % für die Hydrogele A1G4, A4G4, A8G4 bzw. A1G8 betrug. Das darstellende Bild im Zusammenhang mit A4G4 mit Grün zeigt lebende Zellen und Rot zeigt tote Zellen an, dargestellt in Abb. 2C. Der 3D-Z-Stapel ist in Abb. 2D dargestellt und bestätigt die Homogenität lebender Zellen im Konstrukt.

Die gleichmäßige Verteilung und Lebensfähigkeit biogedruckter MDA-MD-231-Zellen. (A) Konzentration und Verteilung der gedruckten Zellen im Konstrukt, Maßstabsbalken, 50 μm (B) Das Histogramm zeigt die Lebensfähigkeit der Zellen in den Hydrogelmischungen unmittelbar nach dem Drucken. (Status des Zellüberlebens anhand des prozentualen Verhältnisses lebender/toter Zellen). Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung von fünf technischen Replikaten von drei biologischen Replikatproben ausgedrückt. Lebend-Tot-Färbung von vier verschiedenen Hydrogelmischungen mit MDA-MB-231-Zellen nach Bioprinting. (C) Das darstellende Bild im Zusammenhang mit A4G4 mit Grün zeigt lebende Zellen und Rot für tote Zellen, Maßstabsleiste, 50 μm (D) Konfokales repräsentatives 3D-Bild für A4G4-Hydrogel. (E) Ergebnisse des MTT-Assays an biogedruckten Konstrukten mit A4G4-Hydrogel, unmittelbar nach dem Drucken (Tag 1), nach 4 Tagen, nach 7 Tagen und nach 11 Tagen. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten von Proben und drei biologischen Replikaten von Negativkontrollen ausgedrückt (kleine Balken – rote Farbe).

Der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wurde an drei Replikaten von 3D-Bioprint-Konstrukten unmittelbar nach dem Drucken und nach Inkubation bei 37 °C, 5 % CO2 in DMEM mit durchgeführt 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin für 4, 7 und 11 Tage. Die Ergebnisse des MTT-Tests sind in Abb. 2E als Absorptionsdaten bei 570 nm dargestellt. Die Daten beziehen sich auf drei Replikate von 3D-Bioprint-Konstrukten und drei Replikate von Negativkontrollkonstrukten (kleine Balken), bei denen es sich um 3D-gedruckte Strukturen ohne Zellen handelt. Eine eindeutig gute Zellverteilung im Konstrukt kann beobachtet werden, wobei die Extinktionswerte unmittelbar nach dem Drucken bei ∼ 0,86 ± 0,02 lagen. Nach 4-tägiger Inkubation wurde ein Anstieg der Absorption gemessen (1,39 ± 0,05) und erreichte am 7. Tag weiterhin 1,94 ± 0,04. Die Lebensfähigkeitsrate stieg im Laufe der Woche im Vergleich zu Tag 1, am 11. Tag war die Absorption jedoch geringer 2,07 ± 0,06, was einen Rückgang der Zellproliferationsrate anzeigt. Es scheint, dass die Konstrukte zwischen Tag 7 und Tag 11 ihre maximale Kapazität zur Aufnahme von Zellen erreichen und später einige Zellen abzusterben beginnen.

MCF7-Krebszellen (eine Brustadenokarzinom-Zelllinie) und MDA-MB-231 (eine aggressivere dreifach negative Brustkrebszelllinie mit mesenchymalen Eigenschaften) werden vor dem Drucken mit grünen bzw. roten Markern vorgefärbt. Im ersten Druckverfahren wurden zwei Biotinten getrennt von jedem Zelltyp hergestellt und nacheinander gedruckt. Die erste Schicht der gedruckten Struktur bestand aus MDA-MB-231-Zellen (rot gefärbt), und die zweite Schicht aus MCF7-Zellen (grün gefärbt) lag auf der ersten Schicht. Im zweiten Druckexperiment wurde eine Biotinte mit der Mischung beider vorgefärbter Zellen im Hydrogel hergestellt und der Biodruck wurde wie zuvor Schicht für Schicht durchgeführt. Abbildung 3A,B zeigt das konfokale Bild der aufeinanderfolgenden biogedruckten Zellen und der biogedruckten Struktur, die jeweils aus einer Mischung beider Zellen besteht. In einem separaten Experiment wurde die Mischung aus MCF7- und MDA-MB-231-Zellen in einer 2D-Kammer gemeinsam kultiviert. Es ist zu erkennen, dass die Zellpopulation und das Zellverhältnis an den Rändern der Kammer im Vergleich zur Kammermitte unterschiedlich sind, während in der 3D-Biodruckstruktur die Zellen homogen angeordnet sind (Abb. 3C–E). Obwohl die Co-Kultivierung von Zellen unter 2D-Bedingungen auch möglich ist, indem man sie über eine dünne Schicht Hydrogel aussät, um die richtigen chemischen Hinweise zu liefern, wäre die Kontrolle der genauen Verteilung der Zellen sehr schwierig. Es ist zu beachten, dass Einzelzellkulturen von MCF7- und MDA-MB-231-Zellen mit und ohne Zellfärbung hergestellt wurden, um die Wirkung der Färbung auf das Zellwachstum zu beobachten. Die Co-Kultur mit einer Mischung beider Zellen wurde ebenfalls mit und ohne Zellfärbung hergestellt. Das Zellwachstum wurde unter einem Mikroskop nach 3 Tagen und 5 Tagen unter beiden Bedingungen beobachtet. Es wurden keine merklichen Unterschiede zwischen Kulturen von Zellen mit und ohne Färbung beobachtet, was zeigt, dass das Färbeverfahren keinen negativen Einfluss auf das Zellwachstum hat (Daten hier nicht gezeigt).

3D-gerenderte konfokale Bilder von MCF7- (grün gefärbt) und MDA-MB-231-Zellen (rot gefärbt): (A) Sequentielles Drucken von MDA-MB-231 und MCF7, (B) Bioprinting eines Konstrukts unter Verwendung eines Bioinks mit einer Mischung aus MCF7- und MDA-MB-231-Zellen; 2D-Kultur beider Zellmischungen im Verhältnis 2:1 (MCF7, grün:MDA-MB-231, rot): (C) Rand der Kulturkammer, (D) Mitte der Kammer, (E) 3D-Bioprinting von Mischzellen im Verhältnis 2:1 (grün:rot). Maßstabsbalken, 50 µm.

Um das Zellwachstum und die Aggregation in biogedruckten Co-Kulturen zu untersuchen, wurde ein 3D-Konstrukt, das aus jedem Zelltyp bestand, separat gedruckt und mit dem Konstrukt verglichen, das aus der Mischung beider Zellen im Bioink bestand. Ein konfokales Mikroskop wurde verwendet, um die Morphologie von MCF7- und MDA-MB-231-Zellen über einen 10-tägigen Versuchszeitraum in den tumorähnlichen Konstrukten zu beobachten (Abb. S2, Hintergrundinformationen). Die konfokale Bildgebung von 3D-biogedruckten Konstrukten in Co-Kultur zeigt, dass am ersten Tag sowohl MCF7-Zellen (rot) als auch MDA-MB-231-Zellen (grün) zufällig in jeder Schicht vorhanden sind, während sie gedruckt wurden. Nach 3 Tagen können beide Zelllinien beobachtet werden, aber es scheint, dass die Zellen in verschiedenen Schichten vorhanden sind und gewandert sind, um Zellcluster zu bilden. „Es scheint, dass MCF7-Zellen eher zu MDA-MB-231 als zu anderen MCF7-Zellen migrieren, da mehr Ansammlungen gemischter Zelltypen beobachtet wurden als nur wenige Ansammlungen von MCF7-Zellen, die ebenfalls beobachtet wurden.“ Die Zellwanderung innerhalb des Hydrogels steht im Einklang mit früheren Berichten, in denen die Porengröße von Alginat-Gelatine-Hydrogelen untersucht wurde38,39.

Hier verwendeten wir den epithelialen Wachstumsfaktor (EGF), ein chemoattraktives Material, um die Zellmigration in Co-Kulturen des Mikrofluidikgeräts zu beobachten. Die extrazellulären biomolekularen Gradienten werden innerhalb von 3D-Hydrogelmatrizen dynamisch über einen linearen Gradienten erzeugt, der die chemischen Umgebungen in Tumorgeweben nachahmen und die Zellmigration steuern soll. Ein Algorithmus wurde verwendet, um die Länge der Zweige in jedem Schritt der Mischkanäle zu ermitteln, wobei davon ausgegangen wurde, dass die Breite der Kanäle und ihre Höhe 400 μm bzw. 50 μm betrugen. Das gesamte Modell ist 21 mm breit und 45 mm lang. Abbildung 4A zeigt die COMSOL-Simulation dieses Geräts, in der Navier-Stokes- und Konvektions-Diffusions-Gleichungen mithilfe der Finite-Elemente-Methode gelöst werden. In dieser Abbildung stellen die Farben Rot und Blau höhere bzw. niedrigere Konzentrationen in [mol/mm3] dar. Der Diffusionskoeffizient wurde mit 109 m2/s angenommen, was ein typischer Wert für wässrige Lösungen ist. Über die Einlässe 1 und 2 sollten reines Wasser als Lösungsmittel und 1 [mol/mm3] wässrige Lösung in den Chip gelangen.

(A) COMSOL-Simulation des Geräts mit Rot und Blau stellen höhere und niedrigere Konzentrationen dar, (B) Gradientenbildung in den 5-Minuten-Intervallen. Die Migration von MDA-MB-231 (grün) und MCF10A (rot) in Richtung EGF in der Mikrofluidikkammer; Abgebildet auf der höheren Konzentration der Kammer vor und nach dem EGF-Gradientenfluss: MDA-MB-231/MCF10A-Verhältnis 1:1 (S11) (C), MCF7/MCF10A-Verhältnis 1:4 (S14) (D) und MDA-MB -231/MCF10A-Verhältnis 4:1 (S41) (E). Für jedes Panel wird der jeweilige Prozentsatz der MDA-MB-231-Zellen vor und nach der EGF-Exposition angezeigt.

Um den chemischen Gradienten zu bestätigen, wurden das Zellkulturmedium und FBS als Quelle an den Einlässen verwendet, um eine visuelle Diffusionsbestätigung zu erhalten. Abbildung 4B zeigt das Bild der Kammer mit 5-Minuten-Intervallen und einer Durchflussrate von 20 μl/min. Der Gradient wurde für mindestens 5 Stunden ohne Strömung erzeugt und erhalten. Die konstruierte Co-Kultur aus gemischtem MCF7 und MDA-MB-231 (Abb. 3B) wurde zur Migrationsstudie von zwei verschiedenen Krebszellen in Richtung des Chemoattraktans getestet (Daten nicht gezeigt). Die Migration von MDA-MB-231 war deutlicher als die von MCF7-Zellen (wie erwartet) und wir wählten MDA-MB-231 für die Zellmigrationsstudie im nächsten Schritt. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Migrationsstudien von MCF7- und MDA-MB-231-Zellen in Richtung Chemoattraktionsmittel in mikrofluidischen Geräten überein40.

Biogedruckte Konstrukte, einschließlich MDA-MB-231 (grün markiert) und MCF10A (rot markiert), wurden in die Gradientenkammer gegeben. Die Flussrate von 5 μl/min wurde mit dem Zellkulturmedium als Quelle für Auslass 1 und Zellkulturmedium mit 100 nM EGF als Quelle für Auslass 2 verwendet. Der Gradient wurde 8 Stunden lang in die Zellen eingeführt, während das gesamte Gerät eingeschaltet war wurde bei 37 °C mit 5 % CO2 aufbewahrt.

Abbildung 4C–E zeigt verschiedene Tumorarchitekturen von MDA-MB-231- und MCF10A-Zellen, biogedruckt mit Verhältnissen von MDA-MB-231/MCF10A: 1/1 (S11), 1/4 (S14) und 4/1 (S41). ). Die linken Felder zeigen die MDA-MB-231- und MCF10A-Verteilung im Tumor vor der Anwendung von EGF und die rechten Felder zeigen ihre Verteilung nach der Anwendung von EGF. Für jedes Panel wurde der Gesamtprozentsatz der MDA-MB-231-Zellen vor und nach der EGF-Exposition berechnet und in den Diagrammen dargestellt. Die höchste Migrationstendenz wird beobachtet, wenn das Verhältnis von Krebszellen zu den umgebenden nicht krebsartigen Zellen 1:1 beträgt (Abb. 4C).

Bei den Patienten wurde eine Tumorheterogenität beobachtet. Brusttumoren sind heterogen und bestehen aus vielen verschiedenen Zelltypen, die das TME bilden. Die Tumorentwicklung und die Mikroumgebungszellen beeinflussen sich gegenseitig durch die Sekretion von Zytokinen, Wachstumsfaktoren usw. Neben der Heterogenität zwischen Krebszellen und Stromazellen weisen auch einzelne Tumoren Heterogenität auf, die erstmals vor etwa vier Jahrzehnten in Mausmodellen beobachtet wurde3 und es wird Intratumor-Heterogenität genannt. Innerhalb einzelner Krebsarten gibt es unterschiedliche Krebszell-Subpopulationen mit unterschiedlicher Metastasierungsfähigkeit aufgrund ihrer unterschiedlichen Darstellung von Tumorentstehung, Signalwegen, Migration und Reaktion auf Krebsmedikamente5,41. Daher muss ein wirksames Modell nicht nur eine Mikroumgebung für das dreidimensionale Wachstum von Zellen bieten, sondern auch Zell-Zell-Interaktionen ermöglichen, um das Fortschreiten des Krebses zu untersuchen. Um genau zu sein, sollte jedes Tumor-on-Chip-Modell die Tumorheterogenität abdecken.

Zuvor werden verschiedene 3D-Gewebemodelle erstellt, um zwei der wichtigsten Faktoren für die Krebssterblichkeit, Angiogenese und Metastasierung, zu untersuchen42. In vielen Fällen von Metastasen ist der Tod die Folge von Fernmetastasen in anderen Organen und Geweben43,44. Die Modellierung der Angiogenese ist auch ein entscheidender Faktor bei der Tumorentwicklung und Metastasierung und ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen vaskulärer Endothelzellen mit Krebszellen, einschließlich der Co-Kultur von Tumorzellen mit Endothelzellen, explantierten Gefäßen oder ausgesäten Zellen, die von mit Tumorzellen beladenen Hydrogelen umgeben sind45, 46,47. Unser Ziel ist es hier, eine Plattform mit 3D-Bioprinting zur Modellierung der phänotypischen Heterogenität zu etablieren, die das Ergebnis unterschiedlicher Zelllokalisation in einem Tumor mithilfe von biogedruckten Tumoren ist.

Die intrinsischen Eigenschaften des Materials (einschließlich Modul, Fließspannung und Viskosität) sind der wichtigste Faktor für seine Bedruckbarkeit, und einige andere äußere Bedingungen sind ebenfalls wichtig, wie etwa der ausgeübte Druck und die Düsengeometrie48. Die Schlüsselkomponente eines erfolgreichen Tumor-3D-Drucks ist die Entwicklung eines geeigneten Bioinks. Hydrogele mit einem Wassergehalt von etwa 99 % sind die Hauptkandidaten für das Bioprinting, da ihr hoher Wassergehalt das Einschließen biologischer Einheiten begünstigt und die Biokompatibilität von Hydrogelen erhöht49. Darüber hinaus haben sie erhebliche Auswirkungen auf die Zellproliferation, Migration, Aggregation und Aktivitäten, die stark von den physikalischen Eigenschaften der Hydrogele abhängen50. Bisher wurden verschiedene Arten synthetischer und natürlicher Polymere für Hydrogelpräparate mit unterschiedlichen Biokompatibilitäten und mechanischen Eigenschaften verwendet50. Polymere mit geringer Zytotoxizität und struktureller Ähnlichkeit zur ECM sind gute Kandidaten für die Herstellung von Bioinks. Die Hauptanforderungen an ein Biodruckmaterial sind (a) Lebensfähigkeit der Zellen, (b) Druckbarkeit (Scherverdünnung, kompatibler Druckdruck, kontinuierliche Extrusion ohne Luftblasen), (c) strukturelle Stabilität (Stabilität einer gedruckten Struktur vor und nach der Vernetzung). ) und (d) schnelle und ungiftige Vernetzung51.

Die ideale Biotinte für das Bioprinting mit Extrusionsverfahren sollte eine relativ hohe Viskosität aufweisen, ein starkes Strukturviskositätsverhalten zeigen und nach dem Drucken schnell vernetzen. Daher haben natürliche Polymere wie Alginat, Gelatine, Chitosan und Hyaluronsäure-Hydrogele aufgrund ihrer hohen Kompatibilität mit Zellumgebungen und ihrer guten Kontrolle über die Menge an ECM-Proteinen und Wachstumsfaktoren mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen51. Ein vielfach untersuchtes Hydrogel ist Alginat, ein natürliches Polysaccharid aus Algen, das einzigartig ist, da es in Gegenwart zweiwertiger Kationen wie Kalzium einen Sol-Gel-Übergang durchläuft. Es verfügt außerdem über optimale Zellverkapselungseigenschaften durch den langsamen Gelierungsprozess bei Raumtemperatur52,53. Allerdings weist Alginat schlechte mechanische Eigenschaften auf. Gelatine ist eher ein hochelastisches als viskoses Material und gilt bei Raumtemperatur als steifer, fester Bioink9, der für Extrusions-Bioprinting-Methoden nicht ideal ist. Wenn andererseits Gelatine mit Alginat-Hydrogelen gemischt wird, um ein Gel in flüssiger Phase zu bilden, können optimale Bedingungen für das Bioprinting durch Extrusion erreicht werden. Frühere Berichte untersuchten Kombinationen von Gelatine und Alginat, die mit Extrusions-Biodruckern kompatibel sind51,54. Sie haben auch gezeigt, dass Gelatine dem Hydrogel elastische Eigenschaften verleiht, die Zelladhäsion verbessert, zur Viskosität des Hydrogels beiträgt und ihm Steifigkeit verleiht55,56.

Eine hohe Scherbeanspruchung kann zu Schäden an der Zellmembran führen. Daher ist die Fähigkeit zur Scherverdünnung wichtig, um die Scherspannung zu reduzieren, die während des Extrusionsprozesses auf die Zellen ausgeübt wird. Ein als druckbar zu betrachtender Bioink sollte die Möglichkeit zur Herstellung einer mehrschichtigen porösen Struktur bieten, ohne nach dem Drucken zusammenzufallen oder durchzuhängen. Damit unsere Tinte druckbar ist, sollte sie eine ausreichende Fließspannung aufweisen, um ein Kollabieren zu verhindern, eine gleichmäßige Extrusion aus der Düse aufweisen, so dass keine Wellen entstehen, und keine „Berge und Täler“ entlang des Extrudats oder Brüche innerhalb eines Filaments aufweisen.

Wir haben verschiedene Hydrogele mit 1–10 % Alginat und 4–10 % Gelatine entwickelt und bei Raumtemperatur gedruckt. Durch Erhöhen der Alginatkonzentration von 1 auf 8 % bei gleichzeitiger Beibehaltung der Gelatinekonzentration von etwa 4 % verbessert sich die Filamentqualität, was mit dem Bericht von Giuseppe57 übereinstimmt, dass eine Erhöhung der Alginat- und Gelatinekonzentration zu genaueren Drucken führte. Eine Erhöhung der Gelatinekonzentration um mehr als 4 % verringert jedoch die Genauigkeit des Drucks. Außerdem ist aufgrund einer verstopften Düse ein höherer Extrusionsdruck erforderlich. Andererseits machten die synergetischen Eigenschaften von Alginat-Gelatine die Kombination von Alginat 1 % und Gelatine 8 % immer noch zu einem guten Kandidaten für präzises Drucken.

Es können mehrere Kriterien für die mechanischen Eigenschaften von Bioink berücksichtigt werden, das wichtigste ist jedoch die Rheologie9. Unter Rheologie versteht man die Messung der Verformung eines Materials, die durch eine auf das Material einwirkende Kraft verursacht wird. Die überwiegende Mehrheit der rheologischen Charakterisierungen von Biotinten konzentriert sich auf die Hydrogelviskosität. Die rheologischen Eigenschaften von Hydrogelproben für vier Kombinationen von A1G4, A1G8, A4G4 und A8G4 (wobei A1G4 Alginat 1 %, Gelatine 4 % usw. darstellt) mit der besten Druckbarkeit wurden untersucht. Hydrogele mit höherer Viskosität unterliegen beim Drucken hohen Scherkräften, um durch die Düse zu extrudieren. Das Scherverdünnungsverhalten ermöglicht hochviskose Hydrogele, die mit struktureller Genauigkeit gedruckt werden können58. Wie in Abb. S1C zu sehen ist, nahm die Viskosität aller Hydrogelmischungen mit zunehmender Schergeschwindigkeit ab und das Strukturviskositätsverhalten wurde für alle vier Proben beobachtet. Die Viskositätskurven aller Hydrogelmischungen zeigten ein ähnliches Muster, was darauf hindeutet, dass alle Hydrogele ein Strukturviskositätsverhalten aufwiesen. Basierend auf der Beobachtung der Verlust- und Speichermoduldaten der in Abb. S1D dargestellten Hydrogele zeigt A4G4 den höchsten Speichermodul (Elastizitätsmodul).

Die Zusammensetzung und die mechanischen Eigenschaften des Hydrogels spielen eine wichtige Rolle für die Lebensfähigkeit der Zellen. Basierend auf den Lebend-Tot-Assay-Ergebnissen, die zuvor in Abb. 2B gezeigt wurden, betrug der Prozentsatz lebensfähiger MDA-MB-231-Zellen unmittelbar nach dem Drucken 94,16 %, 96,94 %, 75,96 % und 84,7 % für die Hydrogele A1G4, A4G4, A8G4 bzw. A1G8. Ein Tropfen des A1G8-Hydrogels, stellvertretend für nicht gedrucktes Gel, wurde zur Vernetzung in CaCl2 gegeben und einem Lebend-Tot-Assay-Prozess unterzogen. Die Zelllebensfähigkeit für A1G8 vor dem Drucken wurde ebenfalls mit 93,4 % ermittelt, was etwas höher ist als die biogedruckte (84,7 %), was im Einklang mit dem Extrusionsverfahren steht, das die Zelllebensfähigkeit beeinflusst. A1G4 und A4G4 zeigen die besten Ergebnisse bei der Lebensfähigkeit der Zellen, allerdings wies A1G4 keine gute Formtreue in der Hydrogelstruktur auf. Basierend auf den Ergebnissen zur Druckbarkeit und Lebensfähigkeit wurde daher A4G4 als optimiertes Hydrogel für die Co-Kulturexperimente ausgewählt. Die ausgezeichnete Lebensfähigkeit, die mit einer Mischung aus 4 % Alginat und 4 % Gelatine erreicht wird, ist auf die weiche Beschaffenheit des Gels und die Zelladhäsion zurückzuführen, die die Gelatine in das Hydrogel einführte. Frühere Berichte bestätigten, dass bei sinkenden Alginatkonzentrationen in Hydrogelzusammensetzungen und steigender Gelatinekonzentration die Gele mechanisch weich werden und eine größere Anzahl an Zelladhäsionseinheiten enthalten59. Unsere Ergebnisse stimmen mit anderen Berichten überein, wonach hochviskose Hydrogele aufgrund des hohen Extrusionsdrucks, der eine höhere Scherspannung auf die Zellen ausübt, zu einer geringeren Lebensfähigkeit der Zellen führen56,60.

Der MTT-Assay, der an den Proben unmittelbar nach dem Drucken sowie nach 4, 7 und 11 Tagen durchgeführt wurde, zeigt die Lebensfähigkeitsrate der 3D-Bioprint-Konstrukte an (Abb. 2E). Die Lebensfähigkeitsrate stieg im Laufe der Woche im Vergleich zum ersten Tag, was die Zugänglichkeit der Zellen zu Sauerstoff und Nährstoffen bestätigt. Die Hydrogel-Konstrukte hatten eine ausreichende Porosität und eine miteinander verbundene Porenstruktur, die die Nährstoffdiffusion innerhalb des Konstrukts gewährleistet und eine geeignete Umgebung für lebende Zellen bietet. Darüber hinaus ermöglicht diese miteinander verbundene poröse Struktur auch die Diffusion von Abfallprodukten aus dem Konstrukt. Am 11. Tag wurde eine Extinktion von 2,07 ± 0,06 beobachtet, was auf einen Rückgang der Zellproliferationsrate hinweist, aber immer noch auf eine sehr gute Lebensfähigkeit der Zellen hinweist. Es scheint, dass die Konstrukte zwischen Tag 7 und Tag 11 ihre maximale Kapazität zur Aufnahme von Zellen erreichen und einige Zellen zu sterben begannen. Diese Ergebnisse bestätigten die gute Biokompatibilität von 3D-Biodruck-Hydrogelkonstrukten und zeigten deren Eignung, Zellen über einen längeren Zeitraum lebensfähig zu halten.

Zur Herstellung von Co-Kulturen durch Bioprinting zweier verschiedener Krebszelllinien wurden MCF7-Krebszellen und MDA-MB-231 vor dem Drucken jeweils mit grünen und roten Markern vorgefärbt. Der Druckvorgang wurde auf zwei Arten durchgeführt, um zwei unterschiedliche Architekturen zu erzeugen, eine mit zwei separaten Zellschichten und die andere mit einer zufälligen Mischung aus zwei Zellen (dargestellt in Abb. 4A, B). Es ist zu beobachten, dass eine gute Kontrolle der Positionierung der Zellen im 3D-Konstrukt erreicht wurde und die Zellen im Vergleich zur in der 2D-Kulturflasche hergestellten Co-Kultur homogen in der Struktur lokalisiert waren (Abb. 3C – E).

Tumor-on-Chip-Modelle erweisen sich im Vergleich zu den anderen Modellen als effizientere Modelle in der Krebsforschung, da sie Gewebe-Gewebe-Wechselwirkungen und die Tumorvaskularisierung nachahmen können61. Die Entwicklung dieser Modelle ist ein fortgeschrittener Schritt des Bioprintings und ermöglicht Hochdurchsatztests, bessere mikrofluidische Simulationen und daher bessere In-vitro- und In-vivo-Korrelationen. Wie in der Einleitung erwähnt, beginnt die metastatische Ausbreitung eines Tumors damit, dass eine Untergruppe von Zellen einen aggressiven Phänotyp annimmt, der es ihnen ermöglicht, sich vom Primärtumor zu lösen und in Richtung eines Sekundärorgans zu wandern. Im Allgemeinen nimmt die metastatische Aktivität von Brustkrebs durch Zell-Matrix-Interaktionen, mechanische Stimulation und die Interaktion von Krebszellen mit Fibroblasten und Immunzellen zu3,62. Daher sollte für die Entwicklung der Metastasierungsaktivität im entworfenen 3D-Tumor die Entwicklung eines heterogenen mehrzelligen Tumors in Betracht gezogen werden.

Es wurden mehrere Subtypen von Brustkrebs definiert, die unterschiedliche Tendenzen zur Metastasierung in den Knochen aufweisen42. In dieser Studie verwendeten wir den epithelialen Wachstumsfaktor (EGF) als chemoattraktives Material und beobachteten die Zellmigration in Co-Kulturen von Krebszellen und nicht-tumorigenen Zellen mithilfe des Mikrofluidikgeräts. Unsere 3D-Mikrofluidikmodelle wurden entwickelt, um die TME-Heterogenität durch Einführung eines chemischen Gradienten zu rekapitulieren, und wir produzieren erstmals eine Krebsmodellierungsplattform durch die Kombination von Mikrofluidikgeräten und 3D-Biodruck. Zur Validierung des Modells wurden dreifach negative bösartige Brustkrebszelllinien (MDA-MB-231) und nicht tumorerzeugende Brustepithelzellen (MCF10A) separat in das Tumormodell eingebettet, die alle während der Experimente eine hohe Lebensfähigkeit aufrechterhielten (Daten nicht gezeigt). Hier). Dann wurden drei verschiedene Tumorarchitekturen von MDA-MB-231- und MCF10A-Zellen mit den folgenden Verhältnissen MDA-MB-231/MCF10A biogedruckt: 1/1 (S11), 1/4 (S14) und 4/1 (S41). und Proben wurden in die Kammer des Mikrofluidikgeräts gegeben. Die Kammer wurde verschlossen und der chemische Gradient von EGF wurde 8 Stunden lang erzeugt. Die Proben wurden vor und nach der Anwendung des Flusses und der Erstellung des EGF-Gradienten abgebildet. Wir verglichen das Verhältnis von MDA-MB-231-Zellen zu MCF10A-Zellen auf dem oberen Teil des Gerüsts, der der höchsten EGF-Konzentration ausgesetzt war. MDA-MB-231 zeigte ein Migrationsverhalten gegenüber EGF und es wurde beobachtet, dass sich viele Zellen an die Oberseite der Kammer bewegten, wo die EGF-Konzentration höher war (Abb. 4C–E, zweite Tafel). Allerdings zeigten MCF10A-umgebende Zellen nur eine geringe Nettomigration. Das Migrationsverhalten war anders, wenn MCF10A-Zellen in der Co-Kultur vorhanden waren, und das Verhältnis von Krebszellen zu nicht krebsartigen Zellen war unterschiedlich. Wir beobachteten die höchste Migrationstendenz, wenn das Verhältnis von Krebszellen zu den umgebenden nicht krebsartigen Zellen 1:1 betrug, wie in Abb. 4C dargestellt. Wenn der umgebende MCF10A-Wert viermal so hoch ist wie der der MBA-MB-231-Krebszellen, ist die Migration vernachlässigbar, und wenn die Krebszellen viermal stärker besiedelt sind als die umgebenden Zellen, verringert sich auch die Migrationsrate. Dies kann auf die Konkurrenz der MDA-MB-231-Zellen um EGF und die Akkumulationskapazität des Gerüsts zurückgeführt werden.

Zelladhäsion ist einer der wichtigen Faktoren bei der Metastasierung. Die Adhäsion zwischen Tumorzellen und ihren Nachbarzellen, insbesondere Fibroblasten, wurde in den letzten zwei Jahrzehnten untersucht63,64. Es wurde gezeigt, dass Fibroblasten als Leitzellen bei der Metastasierung fungieren können, indem sie für eine heterotypische mechanische Adhäsion an Tumorzellen sorgen63,65. Es ist auch bekannt, dass Zelladhäsionsmoleküle, die als Tumorsuppressoren wirken können, bei Krebs verändert sind, sodass die Krebszellen diese Oberflächenmoleküle verlieren können66. Daher können die relative Anzahl der Krebszellen und der umgebenden Zellen sowie die Koordination zwischen gesunden und Krebszellen umeinander eine wichtige Rolle bei der Metastasierung spielen.

Untersuchungen zeigen, dass metastasierter Krebs früher in der Krebsentstehung auftritt, wenn er beispielsweise von einer Zelle ausgeht, die von der Brust wegwandert, bevor sich der Primärtumor vollständig gebildet hat67,68. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die maximale Migration stattfindet, wenn die Anzahl der Krebszellen und der nicht krebsartigen Zellen in der Mikroumgebung ähnlich ist. Wenn daher die Anzahl der Krebszellen viel höher ist als die der umgebenden Zellen, verringert sich möglicherweise die Zellmobilität, da die Krebszellen eine höhere Affinität zueinander haben. Außerdem kann die Interaktion zwischen den beiden verschiedenen Zelltypen die Migration von Tumorzellen nach außen verhindern, wenn die Anzahl der umgebenden gesunden Zellen viel höher ist. Dies steht im Einklang mit früheren Berichten, in denen Fibroblasten die Richtung der Migration bestimmen65. Unser architekturbasiertes Modell für die Migration von Krebszellen könnte in Zukunft wichtige Informationen für die Vorhersage des Zeitpunkts der Metastasierung liefern.

Wir haben erfolgreich ein Tumor-on-Chip-Modell implementiert, das auf dem 3D-Bioprinting von zwei verschiedenen Arten von Brustkrebszellen und nicht tumorigenen Brustepithelzellen basiert. Es ist von entscheidender Bedeutung, die molekularen und zellulären Mechanismen der Tumorheterogenität für die Entwicklung von Behandlungsresistenzen zu verstehen. Da Brustkrebs sowohl bei In-vivo-Brusttumoren als auch bei In-vitro-Zelllinien Heterogenität aufweist, hat die Untersuchung der Tumorheterogenität wichtige Auswirkungen auf die Diagnose, die therapeutische Behandlung und das Verständnis der Chemoresistenz. Selbst in nur einem einzigen Brusttumor können verschiedene Arten von Krebszellpopulationen nebeneinander existieren, was die korrekte Identifizierung der Brustkrebs-Subtypen erschwert. Darüber hinaus zeigen viele Studien, dass Tumorzell-Zell-Interaktionen und Tumor-TME-Interaktionen einen signifikanten Einfluss auf das Fortschreiten und die Invasion von Tumoren haben. Unser heterogenes Tumor-on-Chip-Modell kann enorme Auswirkungen auf die Krebsbehandlungsforschung haben. In dieser Studie haben wir 3D-Bioprinting-Methoden zum Aufbau von In-vitro-Modellen des TME entwickelt, die aus verschiedenen kokultivierten Zelltypen mit kontrollierter Verteilung und Architektur in einer Hydrogelmatrix bestehen. Der Tumor wurde durch ein mit Krebszellen und nicht mit Krebs beladenes Co-Kultur-Hydrogel-Konstrukt dargestellt, während seine Mikroumgebung in einem Mikrofluidik-Chip modelliert wurde, der in der Lage ist, einen chemischen Gradienten zu erzeugen. Wir untersuchten ein zusammengesetztes Hydrogel als Bioink, bestehend aus Alginat und Gelatine, und ein optimierter Bioink wurde für den Biodruck der gemeinsam kultivierten Konstrukte verwendet. Die Morphologie und Verteilung von zwei Krebszelltypen, MCF7 und MDA-MB-231, wurden durch sequentielles Bioprinting und gemischtes Bioink-Bioprinting untersucht, um die Genauigkeit der Zellpositionen nach dem Drucken zu zeigen. Der Gradient des epithelialen Wachstumsfaktors (EGF) wurde als Stimulans verwendet, um die Zellmigration in einem anderen 3D-Zusammensetzungs- und Strukturformat zu untersuchen, einschließlich gemischter Co-Kultursysteme aus nicht tumorerzeugenden Brustepithelzellen, MCF10A und malignen MDA-MB-231-Krebszellen. Abbildung 5 zeigt die Zusammenfassung unseres vorgeschlagenen Krebs-auf-Chip-Modells.

Die Zusammenfassung des vorgeschlagenen Cancer-on-Chip-Modells.

Ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen intratumoraler Heterogenität und dem Ansprechen des Tumors auf die Therapie wird neue Wege für die Entwicklung neuartiger Arzneimittel und die Verwendung bereits zugelassener Verbindungen in neuen Behandlungsschemata oder Kombinationen für wirksamere personalisierte Therapien eröffnen. Unser Tumor-on-Chip-Modell könnte das Verständnis des Verhaltens von Krebszellen in heterogenen Tumoren und ihrer Mikroumgebung erleichtern.

Alle Daten und Materialien sind auf Anfrage erhältlich. Bitte wenden Sie sich an den entsprechenden Autor: [email protected].

Tumor-Mikroumgebung

Zweidimensional

Dreidimensional

Extrazelluläre Matrix

Epithelwachstumsfaktor

Dimethylsulfoxid

Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazol)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid

Fetales Kälberserum

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Wir danken den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (***) für die finanzielle Unterstützung.

Abteilung für Angewandte Mathematik, University of Waterloo, Waterloo, Kanada

Nafiseh Moghimi, Altay Burak Dalan, Dorsa Mohammadrezaei und Mohammad Kohandel

Medizinische Fakultät, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Nafiseh Moghimi & Aaron Goldman

Fakultät für Elektrotechnik, University of Waterloo, Waterloo, Kanada

Habe Ali Hosseini gesehen

Abteilung für Medizinische Genetik, Medizinische Fakultät, Yeditepe-Universität, Istanbul, Türkei

Altay Burak Dalan

Abteilung für Ingenieurwissenschaften in der Medizin, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, USA

Aaron Goldman

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NM entwarf die Experimente, analysierte Daten und schrieb das Manuskript. SAH entwarf das mikrofluidische Gerät und relevante Simulationen. DM half bei Zellkulturexperimenten. ABD half bei Zellkulturexperimenten, der Datenanalyse und der Interpretation der experimentellen Ergebnisse. AG und MK überwachten die Forschung. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt. Alle Autoren lasen das Manuskript und erklärten sich bereit, es in Biomaterials Research zu veröffentlichen.

Korrespondenz mit Nafiseh Moghimi.

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die den Anschein erwecken könnten, dass sie die in diesem Artikel beschriebene Arbeit beeinflusst hätten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Moghimi, N., Hosseini, SA, Dalan, AB et al. Kontrollierte Tumorheterogenität in einem Co-Kultursystem durch ein 3D-biogedrucktes Tumor-on-Chip-Modell. Sci Rep 13, 13648 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40680-x

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Eingegangen: 16. Mai 2023

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 22. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40680-x

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